Salamat sa pagbisita sa nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin ang paggamit ng pinakabagong bersyon ng browser (o pag-disable ng compatibility mode sa Internet Explorer). Bukod pa rito, upang matiyak ang patuloy na suporta, ang site na ito ay magiging libre sa mga style at JavaScript.
Ang kalamnan ng kalansay ay isang heterogeneous na tisyu na pangunahing binubuo ng mga myofibril, na sa mga tao ay karaniwang inuuri sa tatlong uri: isang "mabagal" (uri 1) at dalawang "mabilis" (mga uri 2A at 2X). Gayunpaman, ang heterogeneity sa pagitan at sa loob ng tradisyonal na mga uri ng myofibril ay nananatiling hindi gaanong nauunawaan. Naglapat kami ng mga transcriptomic at proteomic na pamamaraan sa 1050 at 1038 na indibidwal na myofibril mula sa vastus lateralis ng tao, ayon sa pagkakabanggit. Kasama sa pag-aaral ng proteomic ang mga lalaki, at kasama sa pag-aaral ng transcriptomic ang 10 lalaki at 2 babae. Bilang karagdagan sa mga myosin heavy chain isoform, natukoy namin ang mga metabolic protein, ribosomal protein, at cellular junctional protein bilang mga pinagmumulan ng multidimensional intermyofibril variability. Bukod pa rito, sa kabila ng pagtukoy ng mga kumpol ng mabagal at mabilis na mga hibla, iminumungkahi ng aming datos na ang mga type 2X fiber ay hindi maiiba sa iba pang mga fast-twitch fibers. Bukod pa rito, ang klasipikasyon batay sa myosin heavy chain ay hindi sapat upang ilarawan ang myofiber phenotype sa mga nemaline myopathies. Sa pangkalahatan, ang aming datos ay nagmumungkahi ng multidimensional na heterogeneity ng myofiber, na may mga pinagmumulan ng pagkakaiba-iba na lumalampas sa mga isoform ng myosin heavy chain.
Ang heterogeneity ng cellular ay isang likas na katangian ng lahat ng mga biological system, na nagpapahintulot sa mga cell na magpakadalubhasa upang matugunan ang iba't ibang pangangailangan ng mga tisyu at selula.1 Ang tradisyonal na pananaw sa heterogeneity ng hibla ng skeletal muscle ay ang mga motor neuron ay tumutukoy sa uri ng hibla sa loob ng isang motor unit, at ang uri ng hibla (ibig sabihin, uri 1, uri 2A, at uri 2X sa mga tao) ay natutukoy ng mga katangian ng myosin heavy chain (MYH) isoforms.2 Ito ay una batay sa kanilang pH ATPase instability,3,4 at kalaunan ay sa kanilang molecular expression ng MYH.5 Gayunpaman, sa pagkilala at kasunod na pagtanggap ng mga "mixed" fibers na co-express ng maraming MYH sa iba't ibang proporsyon, ang mga hibla ng skeletal muscle ay lalong tinitingnan bilang isang continuum sa halip na bilang magkakaibang uri ng hibla.6 Sa kabila nito, ang larangan ay umaasa pa rin nang malaki sa MYH bilang pangunahing classifier para sa pag-uuri ng myofiber, isang pananaw na malamang na naimpluwensyahan ng mga limitasyon at makabuluhang bias ng mga naunang pag-aaral ng daga na ang mga profile ng ekspresyon ng MYH at hanay ng mga uri ng hibla ay naiiba sa mga nasa mga tao.2 Ang sitwasyon ay lalong pinakomplikado ng katotohanan na ang iba't ibang kalamnan ng kalansay ng tao ay nagpapakita ng magkakaibang hanay ng mga uri ng hibla.7 Ang vastus lateralis ay isang halo-halong kalamnan na may intermediate (at samakatuwid ay kumakatawan) na profile ng ekspresyon ng MYH.7 Bukod pa rito, ang kadalian ng pagkuha ng sample ay ginagawa itong pinakamahusay na pinag-aralang kalamnan sa mga tao.
Kaya naman, ang walang kinikilingang pagsisiyasat sa pagkakaiba-iba ng hibla ng kalamnan ng kalansay gamit ang makapangyarihang mga kagamitang "omics" ay kritikal ngunit mapanghamon din, bahagyang dahil sa multinucleated na katangian ng mga hibla ng kalamnan ng kalansay. Gayunpaman, ang mga teknolohiyang transcriptomics8,9 at proteomics10 ay sumailalim sa isang rebolusyon sa sensitivity nitong mga nakaraang taon dahil sa iba't ibang pagsulong sa teknolohiya, na nagpapahintulot sa pagsusuri ng kalamnan ng kalansay sa single-fiber resolution. Bilang resulta, nakagawa ng makabuluhang pag-unlad sa paglalarawan ng pagkakaiba-iba ng single-fiber at ang kanilang tugon sa atrophic stimuli at pagtanda11,12,13,14,15,16,17,18. Mahalaga, ang mga pagsulong sa teknolohiyang ito ay may mga klinikal na aplikasyon, na nagbibigay-daan para sa mas detalyado at tumpak na paglalarawan ng dysregulation na nauugnay sa sakit. Halimbawa, ang pathophysiology ng nemaline myopathy, isa sa mga pinakakaraniwang minanang sakit sa kalamnan (MIM 605355 at MIM 161800), ay kumplikado at nakalilito.19,20 Samakatuwid, ang isang mas mahusay na paglalarawan ng dysregulation ng mga hibla ng kalamnan ng kalansay ay maaaring humantong sa mga makabuluhang pagsulong sa ating pag-unawa sa sakit na ito.
Bumuo kami ng mga pamamaraan para sa transcriptomic at proteomic analysis ng mga single skeletal muscle fibers na manu-manong inihiwalay mula sa mga specimen ng biopsy ng tao at inilapat ang mga ito sa libu-libong fibers, na nagpapahintulot sa amin na siyasatin ang cellular heterogeneity ng mga human skeletal muscle fibers. Sa kurso ng gawaing ito, ipinakita namin ang kapangyarihan ng transcriptomic at proteomic phenotyping ng mga muscle fibers at natukoy ang metabolic, ribosomal, at cellular junctional proteins bilang mahahalagang pinagmumulan ng interfiber variability. Bukod pa rito, gamit ang proteomic workflow na ito, inilarawan namin ang klinikal na kaugnayan ng nematode myopathy sa mga single skeletal muscle fibers, na nagpapakita ng isang koordinadong paglipat patungo sa mga non-oxidative fibers na hiwalay sa uri ng fiber batay sa MYH.
Upang siyasatin ang heterogeneity ng mga hibla ng kalamnan ng kalansay ng tao, bumuo kami ng dalawang daloy ng trabaho upang paganahin ang transcriptome at proteome analysis ng mga single skeletal muscle fibers (Figure 1A at Supplementary Figure 1A). Bumuo at nag-optimize kami ng ilang metodolohikal na hakbang, mula sa pag-iimbak ng sample at pangangalaga ng integridad ng RNA at protina hanggang sa pag-optimize ng throughput para sa bawat pamamaraan. Para sa transcriptome analysis, nakamit ito sa pamamagitan ng pagpasok ng mga sample-specific molecular barcode sa unang hakbang ng reverse transcription, na nagpapahintulot sa 96 na hibla na maisama para sa mahusay na downstream processing. Ang mas malalim na sequencing (±1 milyong reads bawat hibla) kumpara sa tradisyonal na single-cell approach ay lalong nagpayaman sa datos ng transcriptome. 21 Para sa proteomics, gumamit kami ng maikling chromatographic gradient (21 minuto) na sinamahan ng DIA-PASEF data acquisition sa isang timsTOF mass spectrometer upang ma-optimize ang lalim ng proteome habang pinapanatili ang mataas na throughput. 22,23 Upang siyasatin ang heterogeneity ng malulusog na fibers ng skeletal muscle, inilarawan namin ang mga transcriptome ng 1,050 indibidwal na fibers mula sa 14 na malulusog na adult donor at ang mga proteome ng 1,038 fibers mula sa 5 malulusog na adult donor (Karagdagang Talahanayan 1). Sa papel na ito, ang mga dataset na ito ay tinutukoy bilang 1,000-fiber transcriptome at proteome, ayon sa pagkakabanggit. Ang aming pamamaraan ay nakatukoy ng kabuuang 27,237 transcript at 2,983 na protina sa 1,000-fiber transcriptomic at proteomic analyses (Larawan 1A, Mga Supplementary Dataset 1–2). Matapos salain ang mga transcriptomic at proteomic dataset para sa >1,000 na natukoy na gene at 50% na wastong halaga bawat fiber, ang mga kasunod na bioinformatics analyses ay isinagawa para sa 925 at 974 na fibers sa transcriptome at proteome, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos ng pagsala, isang average na 4257 ± 1557 na gene at 2015 ± 234 na protina (mean ± SD) ang natukoy sa bawat hibla, na may limitadong pagkakaiba-iba sa pagitan ng mga indibidwal (Mga Karagdagang Larawan 1B–C, Mga Supplementary Dataset 3–4). Gayunpaman, ang pagkakaiba-iba sa loob ng paksa ay mas kitang-kita sa mga kalahok, malamang dahil sa mga pagkakaiba sa ani ng RNA/protina sa pagitan ng mga hibla na may iba't ibang haba at cross-sectional area. Para sa karamihan ng mga protina (>2000), ang koepisyent ng pagkakaiba-iba ay mas mababa sa 20% (Karagdagang Larawan 1D). Ang parehong pamamaraan ay nagbigay-daan sa pagkuha ng malawak na dynamic na hanay ng mga transcript at protina na may mataas na ipinahayag na mga lagda na mahalaga para sa pag-urong ng kalamnan (hal., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Mga Supplementary Figure 1E–F). Karamihan sa mga natukoy na katangian ay karaniwan sa pagitan ng mga transcriptomic at proteomic dataset (Karagdagang Larawan 1G), at ang mean na intensidad ng UMI/LFQ ng mga katangiang ito ay may makatwirang kaugnayan (r = 0.52) (Karagdagang Larawan 1H).
Daloy ng trabaho ng transcriptomics at proteomics (nilikha gamit ang BioRender.com). BD Mga kurba ng dinamikong saklaw para sa MYH7, MYH2, at MYH1, at kinakalkulang mga limitasyon para sa pagtatalaga ng uri ng hibla. E, F Distribusyon ng ekspresyon ng MYH sa mga hibla sa mga dataset ng transcriptomics at proteomics. G, H Mga plot ng Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) para sa transcriptomics at proteomics na kinulayan ng uri ng hibla na nakabatay sa MYH. I, J Mga plot ng tampok na nagpapakita ng ekspresyon ng MYH7, MYH2, at MYH1 sa mga dataset ng transcriptomics at proteomics.
Sa simula, sinimulan naming magtalaga ng uri ng hibla na nakabatay sa MYH sa bawat hibla gamit ang isang na-optimize na pamamaraan na sinasamantala ang mataas na sensitivity at dynamic range ng ekspresyon ng MYH sa mga dataset ng omics. Ang mga nakaraang pag-aaral ay gumamit ng mga arbitraryong threshold upang lagyan ng label ang mga hibla bilang purong uri 1, uri 2A, uri 2X, o halo-halong batay sa isang nakapirming porsyento ng ekspresyon ng iba't ibang MYH11,14,24. Gumamit kami ng ibang pamamaraan kung saan ang ekspresyon ng bawat hibla ay niraranggo ayon sa mga MYH na ginamit namin upang i-type ang mga hibla: MYH7, MYH2, at MYH1, na katumbas ng mga hibla na uri 1, uri 2A, at uri 2X, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos ay kinakalkula namin sa matematika ang mas mababang inflection point ng bawat nagreresultang kurba at ginamit ito bilang isang threshold upang magtalaga ng mga hibla bilang positibo (sa itaas ng threshold) o negatibo (sa ibaba ng threshold) para sa bawat MYH (Larawan 1B–D). Ipinapakita ng mga datos na ito na ang MYH7 (Larawan 1B) at MYH2 (Larawan 1C) ay may mas natatanging mga on/off expression profile sa antas ng RNA kumpara sa antas ng protina. Sa katunayan, sa antas ng protina, napakakaunting mga hibla ang hindi nagpahayag ng MYH7, at walang hibla ang may 100% na ekspresyon ng MYH2. Sumunod ay gumamit kami ng mga paunang natukoy na limitasyon ng ekspresyon upang magtalaga ng mga uri ng hibla na nakabatay sa MYH sa lahat ng hibla sa bawat dataset. Halimbawa, ang mga hibla na MYH7+/MYH2-/MYH1- ay itinalaga sa uri 1, habang ang mga hibla na MYH7-/MYH2+/MYH1+ ay itinalaga sa halo-halong uri 2A/2X (tingnan ang Supplementary Table 2 para sa buong paglalarawan). Pinagsama-sama ang lahat ng hibla, naobserbahan namin ang isang kahanga-hangang magkatulad na distribusyon ng mga uri ng hibla na nakabatay sa MYH sa parehong antas ng RNA (Larawan 1E) at protina (Larawan 1F), habang ang relatibong komposisyon ng mga uri ng hibla na nakabatay sa MYH ay iba-iba sa bawat indibidwal, gaya ng inaasahan (Karagdagang Larawan 2A). Karamihan sa mga hibla ay inuri bilang alinman sa purong uri 1 (34–35%) o uri 2A (36–38%), bagaman isang makabuluhang bilang ng mga halo-halong uri 2A/2X na hibla ang natukoy din (16–19%). Ang isang kapansin-pansing pagkakaiba ay ang mga purong uri ng 2X na hibla ay maaari lamang matukoy sa antas ng RNA, ngunit hindi sa antas ng protina, na nagmumungkahi na ang mabilis na ekspresyon ng MYH ay hindi bababa sa bahagyang kinokontrol pagkatapos ng transkripsyon.
Pinatunayan namin ang aming pamamaraan ng pag-type ng MYH fiber na nakabatay sa proteomics gamit ang antibody-based dot blotting, at ang parehong pamamaraan ay nakamit ang 100% na pagkakatugma sa pagtukoy ng purong type 1 at type 2A fibers (tingnan ang Karagdagang Larawan 2B). Gayunpaman, ang pamamaraang nakabatay sa proteomics ay mas sensitibo, mas mahusay sa pagtukoy ng magkahalong fibers, at pagbibilang sa proporsyon ng bawat MYH gene sa bawat fiber. Ipinapakita ng mga datos na ito ang pagiging epektibo ng paggamit ng isang obhetibo at lubos na sensitibong pamamaraang nakabatay sa omics upang makilala ang mga uri ng fiber ng skeletal muscle.
Pagkatapos ay ginamit namin ang pinagsamang impormasyong ibinigay ng transcriptomics at proteomics upang obhetibong uriin ang mga myofiber batay sa kanilang kumpletong transcriptome o proteome. Gamit ang uniform manifold approximation and projection (UMAP) na pamamaraan upang mabawasan ang dimensionality sa anim na pangunahing bahagi (Mga Karagdagang Larawan 3A–B), nagawa naming mailarawan ang pagkakaiba-iba ng myofiber sa transcriptome (Larawan 1G) at proteome (Larawan 1H). Kapansin-pansin, ang mga myofiber ay hindi pinagsama-sama ayon sa mga kalahok (Mga Karagdagang Larawan 3C–D) o mga araw ng pagsubok (Karagdagang Larawan 3E) sa alinman sa mga dataset ng transcriptomics o proteomics, na nagmumungkahi na ang pagkakaiba-iba sa loob ng paksa sa mga hibla ng kalamnan ng skeletal ay mas mataas kaysa sa pagkakaiba-iba sa pagitan ng paksa. Sa plot ng UMAP, lumitaw ang dalawang magkaibang kumpol na kumakatawan sa "mabilis" at "mabagal" na mga myofiber (Mga Larawan 1G–H). Ang mga myofiber na MYH7+ (mabagal) ay nakakumpol sa positibong polo ng UMAP1, samantalang ang mga myofiber na MYH2+ at MYH1+ (mabilis) ay nakakumpol sa negatibong polo ng UMAP1 (Mga Larawan 1I–J). Gayunpaman, walang pagkakaibang ginawa sa pagitan ng mga uri ng hibla na mabilis magkurot (ibig sabihin, uri 2A, uri 2X, o halo-halong 2A/2X) batay sa ekspresyon ng MYH, na nagmumungkahi na ang ekspresyon ng MYH1 (Larawan 1I–J) o iba pang klasikal na 2X myofiber marker tulad ng ACTN3 o MYLK2 (Mga Supplementary Figures 4A–B) ay hindi nagpapaiba sa pagitan ng iba't ibang uri ng myofiber kapag isinasaalang-alang ang buong transcriptome o proteome. Bukod dito, kumpara sa MYH2 at MYH7, kakaunti ang mga transcript o protina na positibong nauugnay sa MYH1 (Mga Supplementary Figs. 4C–H), na nagmumungkahi na ang kasaganaan ng MYH1 ay hindi ganap na sumasalamin sa transcriptome/proteome ng myofiber. Katulad na mga konklusyon ang naabot nang suriin ang magkahalong ekspresyon ng tatlong MYH isoform sa antas ng UMAP (Mga Supplementary Figs. 4I–J). Kaya, habang ang mga 2X fiber ay maaaring matukoy sa antas ng transcript batay sa MYH quantification lamang, ang mga MYH1+ fiber ay hindi mapag-iiba mula sa iba pang mabibilis na fiber kapag isinasaalang-alang ang buong transcriptome o proteome.
Bilang isang paunang paggalugad sa heterogeneity ng mabagal na hibla na lampas sa MYH, sinuri namin ang apat na naitatag na protina na partikular sa uri ng mabagal na hibla: TPM3, TNNT1, MYL3, at ATP2A22. Ang mga subtype ng mabagal na hibla ay nagpakita ng mataas, bagama't hindi perpekto, na mga ugnayan ng Pearson sa MYH7 sa parehong transcriptomics (Karagdagang Larawan 5A) at proteomics (Karagdagang Larawan 5B). Humigit-kumulang 25% at 33% ng mga mabagal na hibla ay hindi inuri bilang purong mabagal na hibla ng lahat ng mga subtype ng gene/protina sa transcriptomics (Karagdagang Larawan 5C) at proteomics (Karagdagang Larawan 5D), ayon sa pagkakabanggit. Samakatuwid, ang pag-uuri ng mabagal na hibla batay sa maraming subtype ng gene/protina ay nagdudulot ng karagdagang pagiging kumplikado, kahit na para sa mga protina na kilalang partikular sa uri ng hibla. Ipinahihiwatig nito na ang pag-uuri ng hibla batay sa mga isoform ng isang pamilya ng gene/protina ay maaaring hindi sapat na sumasalamin sa tunay na heterogeneity ng mga hibla ng kalamnan ng kalansay.
Upang higit pang tuklasin ang phenotypic variability ng mga hibla ng kalamnan ng kalansay ng tao sa laki ng buong modelo ng omics, nagsagawa kami ng unbiased dimensionality reduction ng datos gamit ang principal component analysis (PCA) (Larawan 2A). Katulad ng mga plot ng UMAP, walang naiimpluwensyahan ang kalahok o ang araw ng pagsubok sa fiber clustering sa antas ng PCA (Mga Karagdagang Larawan 6A–C). Sa parehong dataset, ang uri ng hibla na nakabatay sa MYH ay ipinaliwanag ng PC2, na nagpakita ng isang kumpol ng mga hibla na slow-twitch type 1 at isang pangalawang kumpol na naglalaman ng mga hibla na fast-twitch type 2A, type 2X, at mixed 2A/2X (Larawan 2A). Sa parehong dataset, ang dalawang kumpol na ito ay konektado sa pamamagitan ng isang maliit na bilang ng mga hibla na mixed type 1/2A. Gaya ng inaasahan, kinumpirma ng overrepresentation analysis ng mga pangunahing PC driver na ang PC2 ay hinihimok ng mga contractile at metabolic signature (Larawan 2B at Mga Karagdagang Larawan 6D–E, Mga Supplementary Dataset 5–6). Sa pangkalahatan, ang uri ng hibla na nakabatay sa MYH ay natagpuang sapat upang ipaliwanag ang patuloy na pagkakaiba-iba sa kahabaan ng PC2, maliban sa tinatawag na 2X fibers na ipinamahagi sa buong transcriptome sa loob ng fast cluster.
A. Mga plot ng principal component analysis (PCA) ng mga transcriptome at proteome dataset na kinulayan ayon sa uri ng fiber batay sa MYH. B. Pagsusuri ng pagpapayaman ng mga transcript at protein driver sa PC2 at PC1. Isinagawa ang statistical analysis gamit ang clusterProfiler package at mga p-value na inayos ni Benjamini-Hochberg. C, D. Mga plot ng PCA na kinulayan ayon sa mga termino ng intercellular adhesion gene ontology (GO) sa mga termino ng transcriptome at costamere GO sa proteome. Ang mga arrow ay kumakatawan sa mga transcript at protein driver at ang kanilang mga direksyon. E, F. Mga feature plot ng uniform manifold approximation and projection (UMAP) ng mga clinically relevant na tampok na nagpapakita ng mga expression gradient na independiyente sa mabagal/mabilis na uri ng fiber. G, H. Mga ugnayan sa pagitan ng mga PC2 at PC1 driver sa mga transcriptome at proteome.
Hindi inaasahan, ang uri ng myofiber na nakabatay sa MYH ay nagpaliwanag lamang ng pangalawang pinakamataas na antas ng variability (PC2), na nagmumungkahi na ang iba pang mga biological na salik na walang kaugnayan sa uri ng myofiber na nakabatay sa MYH (PC1) ay may mahalagang papel sa pag-regulate ng heterogeneity ng hibla ng skeletal muscle. Ang pagsusuri ng labis na representasyon ng mga nangungunang driver sa PC1 ay nagsiwalat na ang variability sa PC1 ay pangunahing natutukoy ng cell-cell adhesion at nilalaman ng ribosome sa transcriptome, at mga costamere at ribosomal protein sa proteome (Figure 2B at Supplementary Figures 6D–E, Supplementary Data Set 7). Sa skeletal muscle, kinokonekta ng mga costamere ang Z-disc sa sarcolemma at kasangkot sa pagpapadala ng puwersa at pagbibigay ng senyas. Ang 25 na may annotated na PCA plot gamit ang mga katangian ng cell-cell adhesion (transcriptome, Figure 2C) at costamere (proteome, Figure 2D) ay nagsiwalat ng isang malakas na left shift sa PC1, na nagpapahiwatig na ang mga katangiang ito ay pinayaman sa ilang mga hibla.
Ang isang mas detalyadong pagsusuri sa myofiber clustering sa antas ng UMAP ay nagsiwalat na ang karamihan sa mga katangian ay nagpakita ng myofiber type-independent MYH-based expression gradient sa halip na myofiber subcluster-specific. Ang continuity na ito ay naobserbahan para sa ilang mga gene na nauugnay sa mga pathological na kondisyon (Figure 2E), tulad ng CHCHD10 (neuromuscular disease), SLIT3 (muscle atrophy), CTDNEP1 (muscle disease). Ang continuity na ito ay naobserbahan din sa buong proteome, kabilang ang mga protina na nauugnay sa mga neurological disorder (UGDH), insulin signaling (PHIP), at transcription (HIST1H2AB) (Figure 2F). Sa pangkalahatan, ang mga datos na ito ay nagpapahiwatig ng continuity sa fiber type-independent slow/fast twitch heterogeneity sa iba't ibang myofibers.
Kapansin-pansin, ang mga driver gene sa PC2 ay nagpakita ng mahusay na transcriptome-proteome correlation (r = 0.663) (Figure 2G), na nagmumungkahi na ang mga uri ng slow- at fast-twitch fiber, at partikular na ang mga contractile at metabolic properties ng skeletal muscle fibers, ay transcriptionally regulated. Gayunpaman, ang mga driver gene sa PC1 ay walang ipinakitang transcriptome-proteome correlation (r = -0.027) (Figure 2H), na nagmumungkahi na ang mga baryasyon na walang kaugnayan sa slow/fast-twitch fiber types ay higit na kinokontrol pagkatapos ng transkripsyon. Dahil ang mga baryasyon sa PC1 ay pangunahing ipinaliwanag ng mga termino ng ribosomal gene ontology, at dahil ang mga ribosome ay gumaganap ng mahalaga at espesyalisadong papel sa cell sa pamamagitan ng aktibong pakikilahok at pag-impluwensya sa pagsasalin ng protina,31 susunod naming sinisiyasat ang hindi inaasahang ribosomal heterogeneity na ito.
Una naming kinulayan ang plot ng pagsusuri ng pangunahing bahagi ng proteomics ayon sa relatibong kasaganaan ng mga protina sa terminong GOCC na "cytoplasmic ribosome" (Larawan 3A). Bagama't ang terminong ito ay pinayaman sa positibong panig ng PC1, na nagreresulta sa isang maliit na gradient, ang mga ribosomal na protina ay nagtutulak ng paghahati sa magkabilang direksyon ng PC1 (Larawan 3A). Ang mga ribosomal na protina na pinayaman sa negatibong panig ng PC1 ay kinabibilangan ng RPL18, RPS18, at RPS13 (Larawan 3B), habang ang RPL31, RPL35, at RPL38 (Larawan 3C) ang mga pangunahing nagtutulak sa positibong panig ng PC1. Kapansin-pansin, ang RPL38 at RPS13 ay mataas ang ekspresyon sa skeletal muscle kumpara sa iba pang mga tisyu (Karagdagang Larawan 7A). Ang mga natatanging ribosomal na lagda na ito sa PC1 ay hindi naobserbahan sa transcriptome (Karagdagang Larawan 7B), na nagpapahiwatig ng post-transcriptional regulation.
A. Plot ng pagsusuri ng pangunahing sangkap (principal component analysis o PCA) na may kulay ayon sa mga termino ng cytoplasmic ribosomal gene ontology (GO) sa kabuuan ng proteome. Ipinapahiwatig ng mga arrow ang direksyon ng protein-mediated variation sa PCA plot. Ang haba ng linya ay tumutugma sa principal component score para sa isang partikular na protina. B, C. Mga plot ng tampok ng PCA para sa RPS13 at RPL38. D. Hindi pinangangasiwaang hierarchical clustering analysis ng mga cytoplasmic ribosomal protein. E. Modelo ng istruktura ng 80S ribosome (PDB: 4V6X) na nagtatampok ng mga ribosomal protein na may iba't ibang kasaganaan sa mga hibla ng skeletal muscle. F. Mga ribosomal protein na may iba't ibang stoichiometry na naisalokal malapit sa mRNA exit channel.
Ang mga konsepto ng ribosomal heterogeneity at specialization ay naimungkahi na noon, kung saan ang pagkakaroon ng natatanging mga subpopulation ng ribosome (ribosomal heterogeneity) ay maaaring direktang makaimpluwensya sa pagsasalin ng protina sa iba't ibang tisyu32 at mga selula33 sa pamamagitan ng pumipiling pagsasalin ng mga partikular na mRNA transcript pool34 (ribosome specialization). Upang matukoy ang mga subpopulasyon ng mga ribosomal protein na co-expressed sa mga fiber ng skeletal muscle, nagsagawa kami ng isang unsupervised hierarchical clustering analysis ng mga ribosomal protein sa proteome (Figure 3D, Supplementary Data Set 8). Gaya ng inaasahan, ang mga ribosomal protein ay hindi nagkumpol ayon sa uri ng fiber batay sa MYH. Gayunpaman, natukoy namin ang tatlong natatanging kumpol ng mga ribosomal protein; ang unang kumpol (ribosomal_cluster_1) ay coregulated sa RPL38 at samakatuwid ay may pagtaas ng ekspresyon sa mga fiber na may positibong profile ng PC1. Ang pangalawang kumpol (ribosomal_cluster_2) ay coregulated sa RPS13 at nakataas sa mga fiber na may negatibong profile ng PC1. Ang ikatlong kumpol (ribosomal_cluster_3) ay hindi nagpapakita ng koordinadong differential expression sa mga hibla ng kalamnan ng kalansay at maaaring ituring na "core" na protina ng ribosomal ng kalamnan ng kalansay. Ang parehong kumpol ng ribosomal 1 at 2 ay naglalaman ng mga protina ng ribosomal na dati nang naipakita na nagreregula ng alternatibong pagsasalin (hal., RPL10A, RPL38, RPS19, at RPS25) at may functional na impluwensya sa pag-unlad (hal., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Alinsunod sa mga resulta ng PCA, ang naobserbahang heterogeneous na representasyon ng mga protina ng ribosomal na ito sa iba't ibang hibla ay nagpakita rin ng continuity (Karagdagang Larawan 7C).
Upang mailarawan ang lokasyon ng mga heterogeneous na ribosomal na protina sa loob ng ribosome, gumamit kami ng isang istruktural na modelo ng human 80S ribosome (Protein Data Bank: 4V6X) (Larawan 3E). Matapos ihiwalay ang mga ribosomal na protina na kabilang sa iba't ibang kumpol ng ribosomal, ang kanilang mga lokasyon ay hindi magkahanay, na nagmumungkahi na ang aming pamamaraan ay nabigong magbigay ng pagpapayaman para sa ilang partikular na rehiyon/praksyon ng ribosome. Gayunpaman, kapansin-pansin na ang proporsyon ng malalaking subunit na protina sa kumpol 2 ay mas mababa kaysa sa mga kumpol 1 at 3 (Karagdagang Larawan 7D). Naobserbahan namin na ang mga protina na may binagong stoichiometry sa mga hibla ng kalamnan ng kalansay ay pangunahing naka-localize sa ibabaw ng ribosome (Larawan 3E), na naaayon sa kanilang kakayahang makipag-ugnayan sa mga internal ribosome entry site (IRES) na elemento sa iba't ibang populasyon ng mRNA, sa gayon ay kinokoordina ang selective translation. 40, 41 Bukod pa rito, maraming protina na may binagong stoichiometry sa mga hibla ng kalamnan ng kalansay ang matatagpuan malapit sa mga functional na rehiyon tulad ng mRNA exit tunnel (Larawan 3F), na pumipiling kumokontrol sa translational elongation at paghinto ng mga partikular na peptide. 42 Sa buod, iminumungkahi ng aming datos na ang stoichiometry ng mga protina ng ribosomal ng skeletal muscle ay nagpapakita ng heterogeneity, na nagreresulta sa mga pagkakaiba sa pagitan ng mga hibla ng skeletal muscle.
Sumunod naming sinimulang tukuyin ang mga signature ng fiber na mabilis at mabagal ang pagkibot at tuklasin ang mga mekanismo ng kanilang transcriptional regulation. Sa paghahambing ng mga kumpol ng fiber na mabilis at mabagal ang pagkibot na tinukoy ng UMAP sa dalawang dataset (Mga Larawan 1G–H at 4A–B), ang mga transcriptomic at proteomic analyses ay nakatukoy ng 1366 at 804 na magkakaibang katangian, ayon sa pagkakabanggit (Mga Larawan 4A–B, Mga Supplementary Dataset 9–12). Naobserbahan namin ang inaasahang mga pagkakaiba sa mga signature na may kaugnayan sa mga sarcomeres (hal., tropomyosin at troponin), excitation-contraction coupling (SERCA isoforms), at energy metabolism (hal., ALDOA at CKB). Bukod dito, ang mga transcript at protina na kumokontrol sa ubiquitination ng protina ay magkakaibang ipinahayag sa mga fiber na mabilis at mabagal ang pagkibot (hal., USP54, SH3RF2, USP28, at USP48) (Mga Larawan 4A–B). Bukod dito, ang microbial protein gene na RP11-451G4.2 (DWORF), na dati nang naipakita na may iba't ibang ekspresyon sa mga uri ng hibla ng kalamnan ng kordero43 at nagpapahusay sa aktibidad ng SERCA sa kalamnan ng puso44, ay makabuluhang tumaas sa mga hibla ng mabagal na kalamnan ng kalansay (Larawan 4A). Katulad nito, sa indibidwal na antas ng hibla, naobserbahan ang mga makabuluhang pagkakaiba sa mga kilalang lagda tulad ng mga isoform ng lactate dehydrogenase na may kaugnayan sa metabolismo (LDHA at LDHB, Larawan 4C at Supplementary Figure 8A)45,46 pati na rin ang mga dating hindi kilalang lagda na partikular sa uri ng hibla (tulad ng IRX3, USP54, USP28, at DPYSL3) (Larawan 4C). Mayroong isang makabuluhang pagsasanib ng mga katangiang may iba't ibang ekspresyon sa pagitan ng mga transcriptomic at proteomic dataset (Karagdagang Larawan 8B), pati na rin ang isang fold change correlation na pangunahing hinihimok ng mas malinaw na pagkakaiba-ibang ekspresyon ng mga katangian ng sarcomere (Supplementary Figure 8C). Kapansin-pansin, ang ilang mga lagda (hal. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ay nagpakita ng malakas na regulasyon pagkatapos ng transkripsyon sa antas ng proteomic lamang at mayroong mabagal/mabilis na twitch fiber type-specific expression profiles (Karagdagang Larawan 8C).
Mga plot ng bulkan A at B na naghahambing sa mabagal at mabibilis na kumpol na kinilala sa pamamagitan ng mga plot ng uniform manifold approximation and projection (UMAP) sa Mga Larawan 1G–H. Ang mga may kulay na tuldok ay kumakatawan sa mga transcript o protina na may makabuluhang pagkakaiba sa FDR < 0.05, at ang mas madidilim na tuldok ay kumakatawan sa mga transcript o protina na may makabuluhang pagkakaiba sa pagbabago ng log > 1. Ang two-way statistical analysis ay isinagawa gamit ang DESeq2 Wald test na may Benjamini–Hochberg adjusted p values (transcriptomics) o ang Limma linear model method na may empirical Bayesian analysis na sinundan ng Benjamini–Hochberg adjustment para sa maraming paghahambing (proteomics). C Mga signature plot ng mga piling differentially expressed genes o protina sa pagitan ng mabagal at mabibilis na fibers. D Pagsusuri ng pagpapayaman ng mga significantly differentially expressed transcript at protina. Ang mga overlapping value ay pinayaman sa parehong dataset, ang mga transcriptome value ay pinayaman lamang sa transcriptome, at ang mga proteome value ay pinayaman lamang sa proteome. Ang statistical analysis ay isinagawa gamit ang clusterProfiler package na may Benjamini-Hochberg adjusted p-values. E. Mga salik ng transkripsyon na partikular sa uri ng hibla na kinilala ng SCENIC batay sa mga marka ng ispesipikong regulator na nagmula sa SCENIC at magkakaibang ekspresyon ng mRNA sa pagitan ng mga uri ng hibla. F. Pag-profile ng mga piling salik ng transkripsyon na magkakaibang ipinahayag sa pagitan ng mabagal at mabibilis na hibla.
Pagkatapos ay nagsagawa kami ng overrepresentation analysis ng mga gene at protina na may magkakaibang representasyon (Figure 4D, Supplemental Data Set 13). Ang pagpapayaman ng pathway para sa mga katangiang naiiba sa pagitan ng dalawang dataset ay nagpakita ng inaasahang mga pagkakaiba, tulad ng mga proseso ng fatty acid β-oxidation at ketone metabolism (mabagal na hibla), myofilament/muscle contraction (mabilis at mabagal na hibla, ayon sa pagkakabanggit), at mga proseso ng carbohydrate catabolic (mabilis na hibla). Ang aktibidad ng serine/threonine protein phosphatase ay tumaas din sa mabibilis na hibla, na hinimok ng mga katangiang tulad ng regulatory at catalytic phosphatase subunits (PPP3CB, PPP1R3D, at PPP1R3A), na kilala sa pag-regulate ng glycogen metabolism (47) (Supplemental Figures 8D–E). Ang iba pang mga pathway na pinayaman sa mabibilis na hibla ay kinabibilangan ng mga processing (P-) bodies (YTHDF3, TRIM21, LSM2) sa proteome (Supplementary Fig. 8F), na posibleng kasangkot sa post-transcriptional regulation (48), at transcription factor activity (SREBF1, RXRG, RORA) sa transcriptome (Supplementary Fig. 8G). Ang mga mabagal na hibla ay pinayaman sa oxidoreductase activity (BDH1, DCXR, TXN2) (Supplementary Fig. 8H), amide binding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Supplementary Fig. 8I), extracellular matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Supplementary Fig. 8J), at receptor-ligand activity (FNDC5, SPX, NENF) (Supplementary Fig. 8K).
Upang makakuha ng karagdagang kaalaman sa regulasyon ng transkripsyon na pinagbabatayan ng mga katangian ng mabagal/mabilis na uri ng hibla ng kalamnan, nagsagawa kami ng pagsusuri sa pagpapayaman ng salik ng transkripsyon gamit ang SCENIC49 (Supplementary Data Set 14). Maraming salik ng transkripsyon ang lubos na pinayaman sa pagitan ng mabibilis at mabagal na hibla ng kalamnan (Larawan 4E). Kabilang dito ang mga salik ng transkripsyon tulad ng MAFA, na dating naiugnay sa mabilis na pag-unlad ng hibla ng kalamnan,50 pati na rin ang ilang mga salik ng transkripsyon na hindi dating nauugnay sa mga programa ng gene na partikular sa uri ng hibla ng kalamnan. Kabilang sa mga ito, ang PITX1, EGR1, at MYF6 ang pinakamayaman na mga salik ng transkripsyon sa mabibilis na hibla ng kalamnan (Larawan 4E). Sa kabaligtaran, ang ZSCAN30 at EPAS1 (kilala rin bilang HIF2A) ang pinakamayaman na mga salik ng transkripsyon sa mabibilis na hibla ng kalamnan (Larawan 4E). Kasabay nito, ang MAFA ay naipahayag sa mas mataas na antas sa rehiyon ng UMAP na naaayon sa mabibilis na hibla ng kalamnan, habang ang EPAS1 ay may kabaligtaran na pattern ng ekspresyon (Larawan 4F).
Bukod sa mga kilalang protein-coding genes, maraming non-coding RNA biotypes na maaaring kasangkot sa regulasyon ng pag-unlad at sakit ng tao. 51, 52 Sa mga transcriptome dataset, maraming non-coding RNAs ang nagpapakita ng fiber type specificity (Figure 5A at Supplementary Dataset 15), kabilang ang LINC01405, na lubos na tiyak para sa mabagal na fibers at naiulat na nabawasan sa kalamnan mula sa mga pasyenteng may mitochondrial myopathy. 53 Sa kabaligtaran, ang RP11-255P5.3, na katumbas ng lnc-ERCC5-5 gene (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, ay nagpapakita ng fast fiber type specificity. Ang parehong LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) at RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ay nagpapakita ng skeletal muscle specificity (Mga Karagdagang Larawan 9A–B) at walang kilalang contractile genes sa loob ng kanilang 1 Mb genomic neighborhood, na nagmumungkahi na gumaganap sila ng isang espesyalisadong papel sa pag-regulate ng mga uri ng fiber sa halip na pag-regulate ng mga kalapit na contractile genes. Ang mabagal/mabilis na fiber type-specific expression profiles ng LINC01405 at RP11-255P5.3, ayon sa pagkakabanggit, ay nakumpirma gamit ang RNAscope (Mga Larawan 5B–C).
A. Ang mga non-coding RNA transcript ay makabuluhang kinokontrol sa mabagal at mabilis na pagkibot ng mga hibla ng kalamnan. B. Mga representatibong larawan ng RNAscope na nagpapakita ng ispesipisidad ng uri ng mabagal at mabilis na pagkibot ng hibla ng LINC01405 at RP11-255P5.3, ayon sa pagkakabanggit. Scale bar = 50 μm. C. Pagkuwantipika ng ekspresyon ng non-coding RNA na partikular sa uri ng myofiber gaya ng tinutukoy ng RNAscope (n = 3 biopsy mula sa mga independiyenteng indibidwal, na naghahambing ng mabilis at mabagal na hibla ng kalamnan sa loob ng bawat indibidwal). Isinagawa ang statistical analysis gamit ang two-tailed Student's t-test. Ipinapakita ng mga box plot ang median at ang una at ikatlong quartile, na may mga whisker na nakaturo sa minimum at maximum na mga halaga. D. De novo microbial protein identification workflow (nilikha gamit ang BioRender.com). E. Ang microbial protein LINC01405_ORF408:17441:17358 ay partikular na ipinapahayag sa mabagal na mga hibla ng kalamnan ng kalansay (n=5 biopsy mula sa mga independiyenteng kalahok, na naghahambing ng mabilis at mabagal na hibla ng kalamnan sa bawat kalahok). Isinagawa ang pagsusuring istatistikal gamit ang pamamaraan ng Limm linear model na sinamahan ng isang empirical Bayesian approach, na sinundan ng pamamaraang Benjamini-Hochberg para sa maraming paghahambing na may p-value adjustment. Ipinapakita ng mga box plot ang median, una at ikatlong quartile, na may mga whisker na nakaturo sa maximum/minimum na mga halaga.
Kamakailan lamang, ipinakita ng mga pag-aaral na maraming putative non-coding transcripts ang nagko-code ng mga transcribed microbial protein, na ang ilan ay nagreregula sa function ng kalamnan. 44, 55 Upang matukoy ang mga microbial protein na may potensyal na fiber type specificity, hinanap namin ang aming 1000 fiber proteome dataset gamit ang isang custom na FASTA file na naglalaman ng mga sequence ng non-coding transcripts (n = 305) na natagpuan sa 1000 fiber transcriptome dataset (Figure 5D). Natukoy namin ang 197 microbial protein mula sa 22 iba't ibang transcript, 71 sa mga ito ay may magkakaibang regulated sa pagitan ng mabagal at mabilis na skeletal muscle fibers (Supplementary Figure 9C at Supplementary Data Set 16). Para sa LINC01405, tatlong microbial protein products ang natukoy, na ang isa ay nagpakita ng katulad na slow fiber specificity sa transcript nito (Figure 5E at Supplementary Figure 9D). Kaya, natukoy namin ang LINC01405 bilang isang gene na nagko-code ng isang microbial protein na partikular para sa mabagal na skeletal muscle fibers.
Bumuo kami ng isang komprehensibong daloy ng trabaho para sa malawakang proteomic characterization ng mga indibidwal na fiber ng kalamnan at natukoy ang mga regulator ng heterogeneity ng fiber sa malulusog na estado. Inilapat namin ang daloy ng trabahong ito upang maunawaan kung paano nakakaapekto ang mga nemaline myopathies sa heterogeneity ng fiber ng skeletal muscle. Ang mga nemaline myopathies ay mga minanang sakit sa kalamnan na nagdudulot ng panghihina ng kalamnan at, sa mga apektadong bata, ay may kasamang iba't ibang komplikasyon kabilang ang respiratory distress, scoliosis, at limitadong paggalaw ng mga paa. 19,20 Kadalasan, sa mga nemaline myopathies, ang mga pathogenic variant sa mga gene tulad ng actin alpha 1 (ACTA1) ay nagreresulta sa pangingibabaw ng slow-twitch fiber myofiber composition, bagaman ang epektong ito ay heterogeneous. Ang isang kapansin-pansing eksepsiyon ay ang troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), na may pangingibabaw ng mabibilis na fiber. Kaya, ang mas mahusay na pag-unawa sa heterogeneity na pinagbabatayan ng skeletal muscle fiber dysregulation na naobserbahan sa mga nemaline myopathies ay maaaring makatulong upang malutas ang kumplikadong ugnayan sa pagitan ng mga sakit na ito at uri ng myofiber.
Kung ikukumpara sa malulusog na kontrol (n=3 bawat grupo), ang mga myofiber na nakahiwalay mula sa mga pasyenteng may nemaline myopathy na may mga mutasyon sa mga gene na ACTA1 at TNNT1 ay nagpakita ng kapansin-pansing myofiber atrophy o dystrophy (Larawan 6A, Supplementary Table 3). Nagpakita ito ng mga makabuluhang teknikal na hamon para sa proteomic analysis dahil sa limitadong dami ng magagamit na materyal. Sa kabila nito, natuklasan namin ang 2485 na protina sa 272 skeletal myofibers. Matapos i-filter ang hindi bababa sa 1000 na nasukat na protina bawat hibla, 250 hibla ang isinailalim sa kasunod na bioinformatics analysis. Pagkatapos i-filter, isang average na 1573 ± 359 na protina bawat hibla ang nasukat (Supplementary Figure 10A, Supplementary Data Sets 17–18). Kapansin-pansin, sa kabila ng makabuluhang pagbawas sa laki ng hibla, ang lalim ng proteome ng mga sample ng pasyenteng may nemaline myopathy ay katamtaman lamang ang nabawasan. Bukod dito, ang pagproseso ng mga datos na ito gamit ang aming sariling mga FASTA file (kabilang ang mga non-coding transcript) ay nagbigay-daan sa amin na matukoy ang limang microbial protein sa skeletal myofibers mula sa mga pasyenteng may nemaline myopathy (Supplementary Data Set 19). Ang dynamic range ng proteome ay mas malawak, at ang kabuuang protina sa control group ay mahusay na nauugnay sa mga resulta ng isang nakaraang 1000-fiber proteome analysis (Supplementary Fig. 10B–C).
A. Mga mikroskopikong larawan na nagpapakita ng pagkasayang o dystrophy ng hibla at ang pangingibabaw ng iba't ibang uri ng hibla batay sa MYH sa mga nemaline myopathy ng ACTA1 at TNNT1 (NM). Scale bar = 100 μm. Upang matiyak ang reproducibility ng paglamlam sa mga pasyenteng may ACTA1 at TNNT1, tatlong biopsy ng pasyente ang kinulayan nang dalawa hanggang tatlong beses (apat na seksyon bawat kaso) bago pumili ng mga kinatawan na larawan. B. Mga proporsyon ng uri ng hibla sa mga kalahok batay sa MYH. C. Plot ng principal component analysis (PCA) ng mga hibla ng kalamnan ng kalansay sa mga pasyenteng may nemaline myopathy at mga kontrol. D. Mga hibla ng kalamnan ng kalansay mula sa mga pasyenteng may nemaline myopathy at mga kontrol na naka-project sa isang PCA plot na tinukoy mula sa 1000 hibla na sinuri sa Figure 2. Halimbawa, mga plot ng bulkan na naghahambing ng mga pagkakaiba sa pagitan ng mga kalahok na may ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy at mga kontrol, at sa pagitan ng mga kalahok na may ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy. Ang mga may kulay na bilog ay nagpapahiwatig ng mga protina na may makabuluhang pagkakaiba sa π < 0.05, at ang mga maitim na tuldok ay nagpapahiwatig ng mga protina na may makabuluhang pagkakaiba sa FDR < 0.05. Isinagawa ang istatistikal na pagsusuri gamit ang Limma linear model method at empirical Bayesian method, na sinundan ng p-value adjustment para sa maraming paghahambing gamit ang Benjamini-Hochberg method. H. Enrichment analysis ng mga protina na may makabuluhang pagkakaiba sa pagpapahayag sa buong proteome at sa type 1 at 2A fibers. Isinagawa ang istatistikal na pagsusuri gamit ang clusterProfiler package at mga p-value na inayos ni Benjamini-Hochberg. I, J. Principal component analysis (PCA) plots na may kulay ng extracellular matrix at mitochondrial gene ontology (GO) terms.
Dahil ang mga nemaline myopathies ay maaaring makaimpluwensya sa proporsyon ng mga uri ng myofiber na nagpapahayag ng MYH sa skeletal muscle,19,20 una naming sinuri ang mga uri ng myofiber na nagpapahayag ng MYH sa mga pasyenteng may nemaline myopathies at mga kontrol. Natukoy namin ang uri ng myofiber gamit ang isang walang kinikilingang pamamaraan na dati nang inilarawan para sa 1000 myofiber assay (Mga Supplementary Figs. 10D–E) at muling nabigong matukoy ang purong 2X myofibers (Larawan 6B). Naobserbahan namin ang isang magkakaibang epekto ng mga nemaline myopathies sa uri ng myofiber, dahil ang dalawang pasyente na may mga mutasyon ng ACTA1 ay may mas mataas na proporsyon ng type 1 myofibers, samantalang ang dalawang pasyente na may TNNT1 nemaline myopathy ay may mas mababang proporsyon ng type 1 myofibers (Larawan 6B). Sa katunayan, ang ekspresyon ng MYH2 at mga fast troponin isoform (TNNC2, TNNI2, at TNNT3) ay nabawasan sa mga ACTA1-nemaline myopathies, samantalang ang ekspresyon ng MYH7 ay nabawasan sa mga TNNT1-nemaline myopathies (Karagdagang Larawan 11A). Ito ay naaayon sa mga nakaraang ulat ng heterogeneous myofiber type switching sa mga nemaline myopathies.19,20 Kinumpirma namin ang mga resultang ito sa pamamagitan ng immunohistochemistry at natagpuan na ang mga pasyenteng may ACTA1-nemaline myopathy ay may predominance ng type 1 myofibers, samantalang ang mga pasyenteng may TNNT1-nemaline myopathy ay may kabaligtarang pattern (Larawan 6A).
Sa antas ng single-fiber proteome, ang mga hibla ng skeletal muscle mula sa mga pasyenteng may ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy ay nakasama ng karamihan sa mga control fiber, kung saan ang mga hibla ng TNNT1 nemaline myopathy sa pangkalahatan ang pinakamalubhang naapektuhan (Larawan 6C). Ito ay partikular na kitang-kita noong iginuhit ang mga plot ng principal component analysis (PCA) ng mga pseudo-inflated fiber para sa bawat pasyente, kung saan ang mga pasyenteng may TNNT1 nemaline myopathy na 2 at 3 ang lumalabas na pinakamalayo sa mga control sample (Karagdagang Larawan 11B, Supplementary Data Set 20). Upang mas maunawaan kung paano inihahambing ang mga hibla mula sa mga pasyenteng may myopathy sa malulusog na hibla, ginamit namin ang detalyadong impormasyon na nakuha mula sa proteomic analysis ng 1,000 hibla mula sa malulusog na kalahok na nasa hustong gulang. Ipinroyekto namin ang mga hibla mula sa dataset ng myopathy (mga pasyente at kontrol ng ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy) papunta sa PCA plot na nakuha mula sa 1000-fiber proteomic analysis (Larawan 6D). Ang distribusyon ng mga uri ng MYH fiber sa kahabaan ng PC2 sa mga control fiber ay katulad ng distribusyon ng fiber na nakuha mula sa 1000-fiber proteomic analysis. Gayunpaman, karamihan sa mga fiber sa mga pasyenteng may nemaline myopathy ay lumipat pababa sa PC2, na nagsasapawan sa malulusog na fast-twitch fibers, anuman ang kanilang katutubong uri ng MYH fiber. Kaya, bagama't ang mga pasyenteng may ACTA1 nemaline myopathy ay nagpakita ng paglipat patungo sa type 1 fibers nang i-quantify gamit ang mga pamamaraang nakabatay sa MYH, parehong inilipat ng ACTA1 nemaline myopathy at TNNT1 nemaline myopathy ang skeletal muscle fiber proteome patungo sa fast-twitch fibers.
Pagkatapos ay direkta naming inihambing ang bawat grupo ng pasyente sa malulusog na kontrol at natukoy ang 256 at 552 na magkakaibang ipinahayag na mga protina sa ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathies, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 6E–G at Supplementary Figure 11C, Supplementary Data Set 21). Ang pagsusuri ng pagpapayaman ng gene ay nagsiwalat ng isang koordinadong pagbaba sa mga mitochondrial protein (Larawan 6H–I, Supplementary Data Set 22). Nakakagulat, sa kabila ng magkakaibang pangingibabaw ng mga uri ng hibla sa ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathies, ang pagbabang ito ay ganap na independiyente sa uri ng hibla na nakabatay sa MYH (Larawan 6H at Supplementary Figures 11D–I, Supplementary Data Set 23). Tatlong microbial protein ang kinokontrol din sa ACTA1 o TNNT1 nemaline myopathies. Dalawa sa mga microprotein na ito, ang ENSG00000215483_TR14_ORF67 (kilala rin bilang LINC00598 o Lnc-FOXO1) at ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), ay nagpakita lamang ng magkakaibang kasaganaan sa type 1 myofibers. Ang ENSG00000215483_TR14_ORF67 ay naiulat na gumaganap ng papel sa regulasyon ng cell cycle. 56 Sa kabilang banda, ang ENSG00000232046_TR1_ORF437 (katumbas ng LINC01798) ay tumaas sa parehong type 1 at type 2A myofibers sa ACTA1-nemaline myopathy kumpara sa malulusog na kontrol (Karagdagang Larawan 12A, Supplementary Data Set 24). Sa kabaligtaran, ang mga ribosomal na protina ay hindi gaanong naapektuhan ng nemaline myopathy, bagama't ang RPS17 ay nabawasan ang regulasyon sa ACTA1 nemaline myopathy (Fig. 6E).
Ang pagsusuri ng pagpapayaman ay nagsiwalat din ng pagtaas ng regulasyon ng mga proseso ng immune system sa ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy, habang ang pagdikit ng selula ay tumaas din sa TNNT1 nemaline myopathy (Larawan 6H). Ang pagpapayaman ng mga extracellular factor na ito ay makikita sa pamamagitan ng mga extracellular matrix protein na nagbabago ng PCA sa PC1 at PC2 sa isang negatibong direksyon (ibig sabihin, patungo sa mga pinakaapektadong hibla) (Larawan 6J). Ang parehong grupo ng mga pasyente ay nagpakita ng pagtaas ng ekspresyon ng mga extracellular protein na kasangkot sa mga tugon ng immune at mga mekanismo ng pagkukumpuni ng sarcolemmal, tulad ng mga annexin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 at ang kanilang interacting protein na S100A1159 (Mga Supplementary Figures 12B–C). Ang prosesong ito ay naiulat na dati nang pinahusay sa mga muscular dystrophies60 ngunit, sa aming kaalaman, hindi pa ito naiugnay sa mga nemaline myopathy. Ang normal na paggana ng molekular na makinarya na ito ay kinakailangan para sa pagkukumpuni ng sarcolemmal kasunod ng pinsala at para sa pagsasanib ng mga bagong nabuo na myocytes sa myofibers58,61. Kaya naman, ang pagtaas ng aktibidad ng prosesong ito sa parehong grupo ng mga pasyente ay nagmumungkahi ng isang reparative na tugon sa pinsalang dulot ng kawalang-tatag ng myofiber.
Ang mga epekto ng bawat nemaline myopathy ay mahusay na nauugnay (r = 0.736) at nagpakita ng makatwirang pagsasanib (Mga Karagdagang Larawan 11A–B), na nagpapahiwatig na ang ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy ay may magkatulad na epekto sa proteome. Gayunpaman, ang ilang mga protina ay kinokontrol lamang sa ACTA1 o TNNT1 nemaline myopathy (Mga Karagdagang Larawan 11A at C). Ang profibrotic protein na MFAP4 ay isa sa mga pinaka-upregulated na protina sa TNNT1 nemaline myopathy ngunit nanatiling hindi nagbabago sa ACTA1 nemaline myopathy. Ang SKIC8, isang bahagi ng PAF1C complex na responsable para sa pag-regulate ng HOX gene transcription, ay downregulated sa TNNT1 nemaline myopathy ngunit hindi naapektuhan sa ACTA1 nemaline myopathy (Karagdagang Larawan 11A). Ang direktang paghahambing ng ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathy ay nagpakita ng mas malaking pagbawas sa mga mitochondrial protein at pagtaas sa mga immune system protein sa TNNT1 nemaline myopathy (Figure 6G–H at Supplementary Figures 11C at 11H–I). Ang mga datos na ito ay naaayon sa mas malaking atrophy/dystrophy na naobserbahan sa TNNT1 nemaline myopathy kumpara sa TNNT1 nemaline myopathy (Figure 6A), na nagmumungkahi na ang TNNT1 nemaline myopathy ay kumakatawan sa isang mas malalang uri ng sakit.
Upang masuri kung ang mga naobserbahang epekto ng nemaline myopathy ay nagpapatuloy sa buong antas ng kalamnan, nagsagawa kami ng isang bulk proteomic analysis ng mga muscle biopsy mula sa parehong cohort ng mga pasyenteng may TNNT1 nemaline myopathy at inihambing ang mga ito sa mga kontrol (n=3 bawat grupo) (Supplementary Fig. 13A, Supplementary Data Set 25). Gaya ng inaasahan, ang mga kontrol ay malapit na magkakaugnay sa principal component analysis, samantalang ang mga pasyenteng may TNNT1 nemaline myopathy ay nagpakita ng mas mataas na intersample variability na katulad ng nakikita sa single fiber analysis (Supplementary Fig. 13B). Ang bulk analysis ay nagpakita ng mga differentially expressed proteins (Supplementary Fig. 13C, Supplementary Data Set 26) at mga biological process (Supplementary Fig. 13D, Supplementary Data Set 27) na itinampok sa pamamagitan ng paghahambing ng mga indibidwal na fiber, ngunit nawalan ng kakayahang makilala ang pagkakaiba sa pagitan ng iba't ibang uri ng fiber at nabigong isaalang-alang ang mga heterogeneous na epekto ng sakit sa iba't ibang fiber.
Kung pagsasama-samahin, ipinapakita ng mga datos na ito na kayang linawin ng single-myofiber proteomics ang mga klinikal na biyolohikal na katangian na hindi matutukoy ng mga naka-target na pamamaraan tulad ng immunoblotting. Bukod dito, itinatampok ng mga datos na ito ang mga limitasyon ng paggamit lamang ng actin fiber typing (MYH) upang ilarawan ang phenotypic adaptation. Sa katunayan, bagama't magkakaiba ang fiber type switching sa pagitan ng actin at troponin nemaline myopathies, parehong pinaghihiwalay ng nemaline myopathies ang MYH fiber typing mula sa metabolismo ng fiber ng skeletal muscle tungo sa mas mabilis at hindi gaanong oxidative na muscle proteome.
Ang heterogeneity ng mga selula ay mahalaga para matugunan ng mga tisyu ang kanilang magkakaibang pangangailangan. Sa skeletal muscle, madalas itong inilalarawan bilang mga uri ng hibla na nailalarawan sa pamamagitan ng iba't ibang antas ng produksyon ng puwersa at pagkapagod. Gayunpaman, malinaw na ito ay nagpapaliwanag lamang ng isang maliit na bahagi ng pagkakaiba-iba ng hibla ng skeletal muscle, na mas pabagu-bago, kumplikado at maraming aspeto kaysa sa dating inaakala. Ang mga pagsulong sa teknolohiya ngayon ay nagbigay-liwanag sa mga salik na kumokontrol sa mga hibla ng skeletal muscle. Sa katunayan, iminumungkahi ng aming datos na ang mga hibla ng type 2X ay maaaring hindi isang natatanging subtype ng hibla ng skeletal muscle. Bukod dito, natukoy namin ang mga metabolic protein, ribosomal protein at mga protina na nauugnay sa cell bilang mga pangunahing determinant ng heterogeneity ng hibla ng skeletal muscle. Sa pamamagitan ng paglalapat ng aming proteomic workflow sa mga sample ng pasyente na may nematode myopathy, lalo naming ipinakita na ang MYH-based fiber typing ay hindi ganap na sumasalamin sa heterogeneity ng skeletal muscle, lalo na kapag ang sistema ay nababagabag. Sa katunayan, anuman ang uri ng hibla na nakabase sa MYH, ang nematode myopathy ay nagreresulta sa isang paglipat patungo sa mas mabilis at mas kaunting oxidative fibers.
Ang mga hibla ng kalamnan ng kalansay ay inuri na simula pa noong ika-19 na siglo. Ang mga kamakailang pagsusuri ng omics ay nagbigay-daan sa atin upang maunawaan ang mga profile ng ekspresyon ng iba't ibang uri ng hibla ng MYH at ang kanilang mga tugon sa iba't ibang stimuli. Gaya ng inilarawan dito, ang mga pamamaraan ng omics ay mayroon ding bentahe ng mas mataas na sensitibidad para sa pagbibilang ng mga marker ng uri ng hibla kaysa sa mga tradisyonal na pamamaraan na nakabatay sa antibody, nang hindi umaasa sa pagbibilang ng isang (o ilang) marker upang tukuyin ang isang uri ng hibla ng kalamnan ng kalansay. Gumamit kami ng mga komplementaryong transcriptomic at proteomic workflow at isinama ang mga resulta upang suriin ang transcriptional at post-transcriptional na regulasyon ng heterogeneity ng hibla sa mga hibla ng kalamnan ng kalansay ng tao. Ang workflow na ito ay nagresulta sa pagkabigong matukoy ang mga purong 2X-type na hibla sa antas ng protina sa vastus lateralis ng aming pangkat ng malulusog na kabataang lalaki. Ito ay naaayon sa mga nakaraang pag-aaral ng single fiber na natagpuan ang <1% purong 2X na hibla sa malulusog na vastus lateralis, bagaman dapat itong kumpirmahin sa iba pang mga kalamnan sa hinaharap. Ang pagkakaiba sa pagitan ng pagtuklas ng halos purong 2X na hibla sa antas ng mRNA at tanging ang pinaghalong 2A/2X na hibla sa antas ng protina ay nakakalito. Ang ekspresyon ng MYH isoform mRNA ay hindi circadian,67 na nagmumungkahi na malamang na hindi natin "napalampas" ang signal ng pagsisimula ng MYH2 sa tila purong 2X fibers sa antas ng RNA. Ang isang posibleng paliwanag, bagama't purong hipotetikal, ay maaaring ang mga pagkakaiba sa katatagan ng protina at/o mRNA sa pagitan ng mga isoform ng MYH. Sa katunayan, walang mabilis na hibla ang 100% puro para sa anumang isoform ng MYH, at hindi malinaw kung ang mga antas ng ekspresyon ng MYH1 mRNA sa hanay na 70-90% ay magreresulta sa pantay na kasaganaan ng MYH1 at MYH2 sa antas ng protina. Gayunpaman, kapag isinasaalang-alang ang buong transcriptome o proteome, ang cluster analysis ay may kumpiyansang makakatukoy lamang ng dalawang magkakaibang kumpol na kumakatawan sa mabagal at mabilis na mga hibla ng kalamnan ng kalansay, anuman ang kanilang tumpak na komposisyon ng MYH. Ito ay naaayon sa mga pagsusuri gamit ang mga single-nucleus transcriptomic approach, na karaniwang tumutukoy lamang ng dalawang magkakaibang myonuclear cluster. 68, 69, 70 Bukod pa rito, bagama't natukoy ng mga nakaraang pag-aaral ng proteomic ang mga hibla na uri 2X, ang mga hiblang ito ay hindi nagkukumpulan nang hiwalay mula sa iba pang mga mabibilis na hibla at nagpapakita lamang ng kaunting bilang ng mga protina na magkakaiba ang sagana kumpara sa iba pang mga uri ng hibla batay sa MYH. 14 Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na dapat tayong bumalik sa pananaw noong unang bahagi ng ika-20 siglo sa pag-uuri ng hibla ng kalamnan, na hinati ang mga hibla ng kalamnan ng kalansay ng tao hindi sa tatlong magkakaibang klase batay sa MYH, kundi sa dalawang kumpol batay sa kanilang mga katangiang metabolic at contractile. 63
Higit sa lahat, ang heterogeneity ng myofiber ay dapat isaalang-alang sa maraming dimensyon. Ang mga nakaraang pag-aaral sa "omics" ay tumuturo sa direksyong ito, na nagmumungkahi na ang mga hibla ng skeletal muscle ay hindi bumubuo ng mga hiwalay na kumpol ngunit nakaayos sa isang continuum. 11, 13, 14, 64, 71 Dito, ipinapakita namin na, bilang karagdagan sa mga pagkakaiba sa mga katangian ng contractile at metabolic ng skeletal muscle, ang mga myofiber ay maaaring maiba sa pamamagitan ng mga tampok na nauugnay sa mga interaksyon ng cell-cell at mga mekanismo ng pagsasalin. Sa katunayan, natagpuan namin ang heterogeneity ng ribosome sa mga hibla ng skeletal muscle na nakakatulong sa heterogeneity na hiwalay sa mabagal at mabilis na mga uri ng hibla. Ang pinagbabatayan na sanhi ng malaking heterogeneity ng myofiber na ito, na hiwalay sa mabagal at mabilis na uri ng hibla, ay nananatiling hindi malinaw, ngunit maaaring tumutukoy ito sa espesyalisadong spatial na organisasyon sa loob ng mga fascicle ng kalamnan na pinakamainam na tumutugon sa mga partikular na puwersa at karga,72 espesyalisadong komunikasyon na partikular sa cellular o organ sa iba pang mga uri ng cell sa microenvironment ng kalamnan73,74,75 o mga pagkakaiba sa aktibidad ng ribosome sa loob ng mga indibidwal na myofiber. Sa katunayan, ang ribosomal heteroplasmy, alinman sa pamamagitan ng paralogous substitution ng RPL3 at RPL3L o sa antas ng 2′O-methylation ng rRNA, ay naipakita na nauugnay sa skeletal muscle hypertrophy76,77. Ang mga multi-omic at spatial na aplikasyon na sinamahan ng functional characterization ng mga indibidwal na myofiber ay higit na magpapaunlad sa ating pag-unawa sa muscle biology sa antas ng multi-omic78.
Sa pamamagitan ng pagsusuri sa mga proteome ng mga single myofiber mula sa mga pasyenteng may nemaline myopathies, ipinakita rin namin ang gamit, bisa, at kakayahang magamit ng single myofiber proteomics upang maipaliwanag ang klinikal na pathophysiology ng skeletal muscle. Bukod dito, sa pamamagitan ng paghahambing ng aming daloy ng trabaho sa global proteomic analysis, naipakita namin na ang single myofiber proteomics ay nagbubunga ng parehong lalim ng impormasyon gaya ng global tissue proteomics at nagpapalawak ng lalim na ito sa pamamagitan ng pagsasaalang-alang sa interfiber heterogeneity at uri ng myofiber. Bilang karagdagan sa inaasahang (bagaman pabagu-bago) na mga pagkakaiba sa fiber type ratio na naobserbahan sa ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathies kumpara sa malulusog na kontrol,19 naobserbahan din namin ang oxidative at extracellular remodeling na hiwalay sa MYH-mediated fiber type switching. Ang Fibrosis ay naiulat na dati sa mga TNNT1 nemaline myopathies.19 Gayunpaman, ang aming pagsusuri ay nakabatay sa natuklasang ito sa pamamagitan ng pagbubunyag din ng pagtaas ng antas ng mga extracellular secreted stress-related proteins, tulad ng mga annexin, na kasangkot sa mga mekanismo ng pagkukumpuni ng sarcolemmal, sa mga myofiber mula sa mga pasyenteng may ACTA1 at TNNT1 nemaline myopathies.57,58,59 Bilang konklusyon, ang pagtaas ng antas ng annexin sa mga myofiber mula sa mga pasyenteng may nemaline myopathy ay maaaring kumakatawan sa isang tugon ng cellular sa pagkukumpuni ng mga malubhang atrophic myofibers.
Bagama't ang pag-aaral na ito ang kumakatawan sa pinakamalaking single-fiber whole-muscle-omics analysis ng mga tao hanggang sa kasalukuyan, hindi ito walang limitasyon. Inihiwalay namin ang mga hibla ng skeletal muscle mula sa isang medyo maliit at homogenous na sample ng mga kalahok at isang kalamnan (ang vastus lateralis). Samakatuwid, imposibleng ibukod ang pagkakaroon ng mga partikular na populasyon ng fiber sa iba't ibang uri ng kalamnan at sa mga sukdulan ng pisyolohiya ng kalamnan. Halimbawa, hindi namin maaaring ibukod ang posibilidad ng isang subset ng ultrafast fibers (hal., purong 2X fibers) na lumilitaw sa mga highly trained sprinter at/o mga atletang may lakas79 o sa mga panahon ng kawalan ng aktibidad ng kalamnan66,80. Bukod pa rito, ang limitadong laki ng sample ng mga kalahok ay pumigil sa amin na siyasatin ang mga pagkakaiba ng kasarian sa heterogeneity ng fiber, dahil ang mga ratio ng uri ng fiber ay kilalang magkakaiba sa pagitan ng mga kalalakihan at kababaihan. Bukod pa rito, hindi kami nakapagsagawa ng mga transcriptomic at proteomic analyses sa parehong mga fiber ng kalamnan o mga sample mula sa parehong mga kalahok. Habang patuloy naming ino-optimize at ng iba pa ang single-cell at single-myofiber analyses gamit ang omics analysis upang makamit ang ultra-low sample input (tulad ng ipinakita rito sa pagsusuri ng mga fibers mula sa mga pasyenteng may mitochondrial myopathy), nagiging maliwanag ang pagkakataong pagsamahin ang multi-omics (at functional) na mga pamamaraan sa loob ng mga single muscle fibers.
Sa pangkalahatan, tinutukoy at ipinapaliwanag ng aming datos ang mga transcriptional at post-transcriptional na dahilan ng heterogeneity ng skeletal muscle. Sa partikular, inilalahad namin ang datos na humahamon sa isang matagal nang dogma sa pisyolohiya ng skeletal muscle na nauugnay sa klasikal na kahulugan ng mga uri ng fiber batay sa MYH. Umaasa kaming muling mapapanumbalik ang debate at sa huli ay muling pag-isipan ang aming pag-unawa sa klasipikasyon at heterogeneity ng fiber ng skeletal muscle.
Labing-apat na kalahok na Caucasian (12 lalaki at 2 babae) ang kusang-loob na sumang-ayon na lumahok sa pag-aaral na ito. Ang pag-aaral ay inaprubahan ng Ethics Committee ng Ghent University Hospital (BC-10237), sumunod sa 2013 Helsinki Declaration, at nakarehistro sa ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Ang mga pangkalahatang katangian ng mga kalahok ay ipinakita sa Karagdagang Talahanayan 1. Matapos makakuha ng pasalita at nakasulat na pahintulot, ang mga kalahok ay sumailalim sa isang medikal na pagsusuri bago ang pangwakas na pagsasama sa pag-aaral. Ang mga kalahok ay bata (22–42 taong gulang), malusog (walang kondisyong medikal, walang kasaysayan ng paninigarilyo), at katamtamang pisikal na aktibo. Ang pinakamataas na oxygen uptake ay natukoy gamit ang isang step ergometer para sa pagtatasa ng pisikal na kalakasan gaya ng inilarawan dati. 81
Ang mga sample ng muscle biopsy ay kinolekta nang tatlong beses habang nagpapahinga at habang nag-aayuno, na may pagitan na 14 na araw. Dahil ang mga sample na ito ay kinolekta bilang bahagi ng isang mas malaking pag-aaral, ang mga kalahok ay kumonsumo ng placebo (lactose), isang H1-receptor antagonist (540 mg fexofenadine), o isang H2-receptor antagonist (40 mg famotidine) 40 minuto bago ang biopsy. Naipakita na namin dati na ang mga histamine receptor antagonist na ito ay hindi nakakaapekto sa resting skeletal muscle fitness81, at walang state-related clustering na naobserbahan sa aming quality control plots (Mga Karagdagang Larawan 3 at 6). Ang isang standardized diet (41.4 kcal/kg body weight, 5.1 g/kg body weight carbohydrate, 1.4 g/kg body weight protein, at 1.6 g/kg body weight fat) ay pinanatili sa loob ng 48 oras bago ang bawat araw ng eksperimento, at isang standardized breakfast (1.5 g/kg body weight carbohydrate) ang kinain sa umaga ng araw ng eksperimento. Sa ilalim ng lokal na anestesya (0.5 ml 1% lidocaine na walang epinephrine), ang mga biopsy ng kalamnan ay kinuha mula sa kalamnan ng vastus lateralis gamit ang percutaneous Bergström aspiration.82 Ang mga sample ng kalamnan ay agad na inilagay sa RNA at iniimbak sa 4°C hanggang sa manual fiber dissection (hanggang 3 araw).
Ang mga bagong hiwalay na myofiber bundles ay inilipat sa sariwang RNAlater medium sa isang culture dish. Ang mga indibidwal na myofiber ay manu-manong dine-dissect gamit ang stereomicroscope at pinong sipit. Dalawampu't limang hibla ang dine-dissect mula sa bawat biopsy, na binibigyang-pansin ang pagpili ng mga hibla mula sa iba't ibang bahagi ng biopsy. Pagkatapos ng dissection, ang bawat hibla ay dahan-dahang inilubog sa 3 μl ng lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) na naglalaman ng proteinase K at mga DNase enzyme upang alisin ang mga hindi gustong protina at DNA. Ang cell lysis at pag-alis ng protina/DNA ay sinimulan sa pamamagitan ng maikling vortexing, pag-ikot ng likido sa isang microcentrifuge, at incubation sa temperatura ng silid (10 minuto). Ang lysate ay pagkatapos ay in-incubate sa isang thermal cycler (T100, Bio-Rad) sa 37°C sa loob ng 5 minuto, 75°C sa loob ng 5 minuto, at pagkatapos ay agad na iniimbak sa -80°C hanggang sa karagdagang pagproseso.
Ang mga Illumina-compatible polyadenylated RNA libraries ay inihanda mula sa 2 µl ng myofiber lysate gamit ang QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Ang mga detalyadong pamamaraan ay matatagpuan sa manwal ng tagagawa. Ang proseso ay nagsisimula sa first-strand cDNA synthesis sa pamamagitan ng reverse transcription, kung saan ipinakilala ang mga unique molecular identifiers (UMIs) at sample-specific i1 barcodes upang matiyak ang pagsasama-sama ng mga sample at mabawasan ang teknikal na pagkakaiba-iba sa panahon ng downstream processing. Ang cDNA mula sa 96 myofibers ay pagkatapos ay pinagsasama-sama at pinadalisay gamit ang magnetic beads, pagkatapos nito ay inaalis ang RNA at isinasagawa ang second-strand synthesis gamit ang mga random primer. Ang library ay pinadalisay gamit ang magnetic beads, idinaragdag ang pool-specific i5/i7 tags, at pinalaki ang PCR. Ang pangwakas na hakbang sa paglilinis ay lumilikha ng mga Illumina-compatible libraries. Ang kalidad ng bawat library pool ay tinasa gamit ang High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Batay sa Qubit quantification, ang mga pool ay pinagsama-sama pa sa mga equimolar concentrations (2 nM). Ang nagresultang pool ay sinundan ng sequence sa isang NovaSeq 6000 instrument sa standard mode gamit ang NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) na may 2 nM loading (4% PhiX).
Ang aming pipeline ay batay sa pipeline ng pagsusuri ng datos ng QuantSeq Pool ng Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Ang datos ay unang di-multiplex gamit ang bcl2fastq2 (v2.20.0) batay sa i7/i5 index. Ang Read 2 ay di-multiplex gamit ang idemux (v0.1.6) batay sa i1 sample barcode at ang mga UMI sequence ay kinuha gamit ang umi_tools (v1.0.1). Ang mga read ay pagkatapos ay pinutol gamit ang cutadapt (v3.4) sa maraming round upang alisin ang maiikling read (<20 ang haba) o mga read na binubuo lamang ng mga adapter sequence. Ang mga read ay pagkatapos ay inihanay sa human genome gamit ang STAR (v2.6.0c) at ang mga BAM file ay na-index gamit ang SAMtools (v1.11). Ang mga duplicate read ay inalis gamit ang umi_tools (v1.0.1). Panghuli, ang pagbibilang ng alignment ay isinagawa gamit ang featureCounts sa Subread (v2.0.3). Isinagawa ang kontrol sa kalidad gamit ang FastQC (v0.11.9) sa ilang mga yugto sa pagitan ng pipeline.
Ang lahat ng karagdagang pagproseso at biswalisasyon ng bioinformatics ay isinagawa sa R (v4.2.3), pangunahin gamit ang daloy ng trabaho ng Seurat (v4.4.0). 83 Samakatuwid, ang mga indibidwal na halaga ng UMI at mga metadata matrice ay binago sa mga bagay na Seurat. Ang mga gene na ipinahayag sa wala pang 30% ng lahat ng mga hibla ay tinanggal. Ang mga sample na mababa ang kalidad ay tinanggal batay sa isang minimum na threshold na 1000 na halaga ng UMI at 1000 natukoy na mga gene. Sa huli, 925 na hibla ang nakapasa sa lahat ng mga hakbang sa pagsala ng kontrol sa kalidad. Ang mga halaga ng UMI ay na-normalize gamit ang pamamaraan ng Seurat SCTransform v2, 84 kabilang ang lahat ng 7418 na natukoy na mga tampok, at ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga kalahok ay na-regress. Ang lahat ng nauugnay na metadata ay matatagpuan sa Supplementary Dataset 28.
Oras ng pag-post: Set-10-2025