Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamahusay na mga resulta, inirerekomenda namin ang paggamit ng isang mas bagong browser (o i-disable ang compatibility mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang pagtatatag ng mga modelo ng hayop ng modic change (MC) ay isang mahalagang batayan para sa pag-aaral ng MC. Limampu't apat na New Zealand White rabbits ang nahahati sa sham-operation group, muscle implantation group (ME group) at nucleus pulposus implantation group (NPE group). Sa pangkat ng NPE, ang intervertebral disc ay nalantad sa pamamagitan ng anterolateral lumbar surgical approach at isang karayom ang ginamit upang mabutas ang L5 vertebral body malapit sa end plate. Ang NP ay nakuha mula sa L1/2 intervertebral disc sa pamamagitan ng isang syringe at iniksyon dito. Pagbabarena ng butas sa subchondral bone. Ang mga pamamaraan ng pag-opera at mga pamamaraan ng pagbabarena sa grupo ng pagtatanim ng kalamnan at sa grupo ng sham-operation ay pareho sa mga nasa pangkat ng pagtatanim ng NP. Sa grupong ME, isang piraso ng kalamnan ang inilagay sa butas, habang sa grupo ng sham-operation, walang inilagay sa butas. Pagkatapos ng operasyon, isinagawa ang pag-scan ng MRI at molecular biological testing. Ang signal sa pangkat ng NPE ay nagbago, ngunit walang malinaw na pagbabago ng signal sa pangkat ng sham-operation at sa grupo ng ME. Ang pagmamasid sa kasaysayan ay nagpakita na ang abnormal na paglaganap ng tisyu ay naobserbahan sa site ng implantasyon, at ang pagpapahayag ng IL-4, IL-17 at IFN-γ ay nadagdagan sa pangkat ng NPE. Ang pagtatanim ng NP sa subchondral bone ay maaaring bumuo ng isang modelo ng hayop ng MC.
Ang mga pagbabago sa modic (MC) ay mga sugat ng vertebral endplates at katabing bone marrow na nakikita sa magnetic resonance imaging (MRI). Ang mga ito ay karaniwan sa mga indibidwal na may kaugnay na mga sintomas1. Maraming mga pag-aaral ang nagbigay-diin sa kahalagahan ng MC dahil sa pagkakaugnay nito sa mababang sakit sa likod (LBP)2,3. Independyenteng unang inilarawan ni de Roos et al.4 at Modic et al.5 ang tatlong magkakaibang uri ng subchondral signal abnormalities sa vertebral bone marrow. Ang mga pagbabago sa modic type I ay hypointense sa T1-weighted (T1W) sequence at hyperintense sa T2-weighted (T2W) sequence. Ang sugat na ito ay nagpapakita ng mga fissure endplates at katabing vascular granulation tissue sa bone marrow. Ang mga pagbabago sa modic type II ay nagpapakita ng mataas na signal sa parehong T1W at T2W sequence. Sa ganitong uri ng sugat, makikita ang pagkasira ng endplate, pati na rin ang histological fatty replacement ng katabing bone marrow. Ang mga pagbabago sa modic type III ay nagpapakita ng mababang signal sa mga sequence ng T1W at T2W. Ang mga sclerotic lesyon na naaayon sa mga endplate ay naobserbahan6. Ang MC ay itinuturing na isang pathological na sakit ng gulugod at malapit na nauugnay sa maraming mga degenerative na sakit ng gulugod7,8,9.
Isinasaalang-alang ang magagamit na data, maraming mga pag-aaral ang nagbigay ng detalyadong mga pananaw sa etiology at pathological na mekanismo ng MC. Albert et al. Iminungkahi na ang MC ay maaaring sanhi ng disc herniation8. Hu et al. iniuugnay ang MC sa malubhang pagkabulok ng disc10. Iminungkahi ni Kroc ang konsepto ng "internal disc rupture," na nagsasaad na ang paulit-ulit na trauma ng disc ay maaaring humantong sa microtears sa endplate. Matapos ang pagbuo ng cleft, ang pagkasira ng endplate ng nucleus pulposus (NP) ay maaaring mag-trigger ng isang autoimmune na tugon, na higit na humahantong sa pagbuo ng MC11. Ma et al. nagbahagi ng isang katulad na pananaw at iniulat na ang NP-induced autoimmunity ay may mahalagang papel sa pathogenesis ng MC12.
Ang mga selula ng immune system, lalo na ang CD4+ T helper lymphocytes, ay gumaganap ng isang kritikal na papel sa pathogenesis ng autoimmunity13. Ang kamakailang natuklasang Th17 subset ay gumagawa ng proinflammatory cytokine na IL-17, nagpo-promote ng chemokine expression, at pinasisigla ang mga T cells sa mga nasirang organo upang makagawa ng IFN-γ14. Ang mga cell ng Th2 ay gumaganap din ng isang natatanging papel sa pathogenesis ng mga tugon ng immune. Ang pagpapahayag ng IL-4 bilang isang kinatawan ng Th2 cell ay maaaring humantong sa malubhang immunopathological na kahihinatnan15.
Bagama't maraming klinikal na pag-aaral ang isinagawa sa MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, kulang pa rin ang angkop na mga modelo ng eksperimentong hayop na maaaring gayahin ang proseso ng MC na madalas na nangyayari sa mga tao at maaaring ginagamit upang siyasatin ang etiology o mga bagong paggamot gaya ng naka-target na therapy. Sa ngayon, kakaunti lamang ang mga modelo ng hayop ng MC na naiulat na pag-aralan ang pinagbabatayan na mga mekanismo ng pathological.
Batay sa teorya ng autoimmune na iminungkahi nina Albert at Ma, ang pag-aaral na ito ay nagtatag ng isang simple at reproducible na modelo ng rabbit MC sa pamamagitan ng autotransplanting NP malapit sa drilled vertebral end plate. Ang iba pang mga layunin ay upang obserbahan ang mga histological na katangian ng mga modelo ng hayop at suriin ang mga tiyak na mekanismo ng NP sa pagbuo ng MC. Sa layuning ito, gumagamit kami ng mga diskarte tulad ng molecular biology, MRI, at histological na pag-aaral upang pag-aralan ang pag-unlad ng MC.
Dalawang kuneho ang namatay sa pagdurugo sa panahon ng operasyon, at apat na kuneho ang namatay sa panahon ng anesthesia sa panahon ng MRI. Ang natitirang 48 kuneho ay nakaligtas at hindi nagpakita ng mga asal o neurological na palatandaan pagkatapos ng operasyon.
Ipinapakita ng MRI na ang intensity ng signal ng naka-embed na tissue sa iba't ibang mga butas ay iba. Ang intensity ng signal ng L5 vertebral body sa NPE group ay unti-unting nagbago sa 12, 16 at 20 na linggo pagkatapos ng pagpasok (T1W sequence ay nagpakita ng mababang signal, at ang T2W sequence ay nagpakita ng halo-halong signal kasama ang mababang signal) (Fig. 1C), habang ang mga pagpapakita ng MRI ng iba pang dalawang grupo ng mga naka-embed na bahagi ay nanatiling medyo matatag sa parehong panahon (Larawan 1A, B).
(A) Representative sequential MRIs ng rabbit lumbar spine sa 3 time point. Walang nakitang abnormal na signal sa mga larawan ng sham-operation group. (B) Ang mga katangian ng signal ng vertebral body sa ME group ay katulad ng sa sham-operation group, at walang makabuluhang pagbabago sa signal ang naobserbahan sa lugar ng pag-embed sa paglipas ng panahon. (C) Sa pangkat ng NPE, ang mababang signal ay malinaw na nakikita sa T1W sequence, at ang magkahalong signal at mababang signal ay malinaw na nakikita sa T2W sequence. Mula sa 12-linggo na panahon hanggang sa 20-linggo na panahon, bumababa ang kalat-kalat na mataas na signal na pumapalibot sa mababang signal sa T2W sequence.
Ang halatang bone hyperplasia ay makikita sa implantation site ng vertebral body sa NPE group, at ang bone hyperplasia ay nangyayari nang mas mabilis mula 12 hanggang 20 na linggo (Fig. 2C) kumpara sa NPE group, walang makabuluhang pagbabago ang naobserbahan sa modeled vertebral katawan; Sham group at ME group (Fig. 2C) 2A,B).
(A) Ang ibabaw ng vertebral body sa implanted na bahagi ay napakakinis, ang butas ay gumagaling nang maayos, at walang hyperplasia sa vertebral body. (B) Ang hugis ng implanted site sa ME group ay katulad ng sa sham operation group, at walang malinaw na pagbabago sa hitsura ng implanted site sa paglipas ng panahon. (C) Ang bone hyperplasia ay naganap sa implanted site sa pangkat ng NPE. Ang bone hyperplasia ay mabilis na tumaas at pinalawak pa sa pamamagitan ng intervertebral disc hanggang sa contralateral vertebral body.
Nagbibigay ang histological analysis ng mas detalyadong impormasyon tungkol sa pagbuo ng buto. Ipinapakita ng Figure 3 ang mga litrato ng mga postoperative section na nabahiran ng H&E. Sa sham-operation group, ang mga chondrocytes ay maayos na nakaayos at walang cell proliferation ang nakita (Fig. 3A). Ang sitwasyon sa ME group ay katulad ng sa sham-operation group (Larawan 3B). Gayunpaman, sa pangkat ng NPE, isang malaking bilang ng mga chondrocytes at paglaganap ng mga cell na tulad ng NP ay naobserbahan sa site ng pagtatanim (Larawan 3C);
(A) Ang Trabeculae ay makikita malapit sa dulong plato, ang mga chondrocytes ay maayos na nakaayos na may pare-parehong laki at hugis ng cell at walang proliferation (40 beses). (B) Ang kondisyon ng implantation site sa ME group ay katulad ng sa sham group. Ang mga trabeculae at chondrocytes ay makikita, ngunit walang halatang paglaganap sa lugar ng pagtatanim (40 beses). (B) Makikita na ang chondrocytes at NP-like cells ay dumarami nang malaki, at ang hugis at sukat ng chondrocytes ay hindi pantay (40 beses).
Ang pagpapahayag ng interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA, at interferon γ (IFN-γ) mRNA ay naobserbahan sa parehong mga pangkat ng NPE at ME. Kapag inihambing ang mga antas ng pagpapahayag ng mga target na gene, ang mga expression ng gene ng IL-4, IL-17, at IFN-γ ay makabuluhang nadagdagan sa pangkat ng NPE kumpara sa pangkat ng ME at pangkat ng pagpapatakbo ng sham (Fig. 4) (P <0.05). Kung ikukumpara sa sham operation group, ang mga antas ng expression ng IL-4, IL-17, at IFN-γ sa ME group ay tumaas lamang nang bahagya at hindi umabot sa pagbabago sa istatistika (P > 0.05).
Ang expression ng mRNA ng IL-4, IL-17 at IFN-γ sa pangkat ng NPE ay nagpakita ng isang makabuluhang mas mataas na takbo kaysa sa mga nasa sham operation group at ME group (P <0.05).
Sa kaibahan, ang mga antas ng expression sa pangkat ng ME ay nagpakita ng walang makabuluhang pagkakaiba ( P > 0.05).
Ang pagsusuri sa Western blot ay isinagawa gamit ang mga antibodies na magagamit sa komersyo laban sa IL-4 at IL-17 upang kumpirmahin ang binagong pattern ng expression ng mRNA. Tulad ng ipinapakita sa Mga Figure 5A, B, kumpara sa ME group at sham operation group, ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 sa pangkat ng NPE ay makabuluhang nadagdagan (P <0.05). Kung ikukumpara sa sham operation group, ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 sa ME group ay nabigo din na maabot ang mga makabuluhang pagbabago sa istatistika (P> 0.05).
(A) Ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 sa pangkat ng NPE ay makabuluhang mas mataas kaysa sa mga nasa pangkat ng ME at pangkat ng placebo (P <0.05). (B) Western blot histogram.
Dahil sa limitadong bilang ng mga sample ng tao na nakuha sa panahon ng operasyon, ang malinaw at detalyadong pag-aaral sa pathogenesis ng MC ay medyo mahirap. Sinubukan naming magtatag ng isang modelo ng hayop ng MC upang pag-aralan ang mga potensyal na mekanismo ng pathological nito. Kasabay nito, ang pagsusuri ng radiological, pagsusuri sa histological at pagsusuri ng molekular na biological ay ginamit upang sundin ang kurso ng MC na sapilitan ng NP autograft. Bilang resulta, ang modelo ng implantation ng NP ay nagresulta sa isang unti-unting pagbabago sa intensity ng signal mula 12-linggo hanggang 20-linggo na mga punto ng oras (halo-halong mababang signal sa mga pagkakasunud-sunod ng T1W at mababang signal sa mga pagkakasunud-sunod ng T2W), na nagpapahiwatig ng mga pagbabago sa tissue, at ang histological at molekular kinumpirma ng mga biological na pagsusuri ang mga resulta ng radiological study.
Ang mga resulta ng eksperimentong ito ay nagpapakita na ang mga visual at histological na pagbabago ay naganap sa site ng vertebral body infringement sa pangkat ng NPE. Kasabay nito, ang expression ng IL-4, IL-17 at IFN-γ genes, pati na rin ang IL-4, IL-17 at IFN-γ ay naobserbahan, na nagpapahiwatig na ang paglabag ng autologous nucleus pulposus tissue sa vertebral katawan ay maaaring maging sanhi ng isang serye ng signal at morphological pagbabago. Madaling mahanap na ang mga katangian ng signal ng mga vertebral na katawan ng modelo ng hayop (mababang signal sa pagkakasunud-sunod ng T1W, halo-halong signal at mababang signal sa pagkakasunud-sunod ng T2W) ay halos kapareho sa mga vertebral cell ng tao, at ang mga katangian ng MRI din kumpirmahin ang mga obserbasyon ng histology at gross anatomy, iyon ay, ang mga pagbabago sa vertebral body cells ay progresibo. Kahit na ang nagpapaalab na tugon na dulot ng matinding trauma ay maaaring lumitaw sa lalong madaling panahon pagkatapos ng pagbutas, ang mga resulta ng MRI ay nagpakita na ang unti-unting pagtaas ng mga pagbabago sa signal ay lumitaw 12 linggo pagkatapos ng pagbutas at nagpatuloy hanggang sa 20 linggo nang walang anumang mga palatandaan ng pagbawi o pagbabalik ng mga pagbabago sa MRI. Iminumungkahi ng mga resultang ito na ang autologous vertebral NP ay isang maaasahang pamamaraan para sa pagtatatag ng progresibong MV sa mga kuneho.
Ang modelo ng pagbutas na ito ay nangangailangan ng sapat na kasanayan, oras, at pagsisikap sa operasyon. Sa mga paunang eksperimento, ang dissection o labis na pagpapasigla ng paravertebral ligamentous structures ay maaaring magresulta sa pagbuo ng vertebral osteophytes. Ang pag-iingat ay dapat gawin upang hindi makapinsala o makairita sa mga katabing disc. Dahil ang lalim ng pagtagos ay dapat kontrolin upang makakuha ng pare-pareho at maaaring kopyahin ang mga resulta, manu-mano kaming gumawa ng isang plug sa pamamagitan ng pagputol ng kaluban ng isang 3 mm na haba ng karayom. Ang paggamit ng plug na ito ay nagsisiguro ng pare-parehong lalim ng pagbabarena sa vertebral body. Sa mga paunang eksperimento, nakita ng tatlong orthopedic surgeon na kasangkot sa operasyon ang 16-gauge na karayom na mas madaling gamitin kaysa 18-gauge na karayom o iba pang mga pamamaraan. Upang maiwasan ang labis na pagdurugo sa panahon ng pagbabarena, ang paghawak sa karayom nang ilang sandali ay magbibigay ng mas angkop na butas sa pagpasok, na nagmumungkahi na ang isang tiyak na antas ng MC ay maaaring kontrolin sa ganitong paraan.
Bagaman maraming pag-aaral ang naka-target sa MC, kaunti ang nalalaman tungkol sa etiology at pathogenesis ng MC25,26,27. Batay sa aming mga nakaraang pag-aaral, nalaman namin na ang autoimmunity ay may mahalagang papel sa paglitaw at pag-unlad ng MC12. Sinuri ng pag-aaral na ito ang quantitative expression ng IL-4, IL-17, at IFN-γ, na siyang pangunahing mga pathway ng pagkita ng kaibhan ng CD4+ cells pagkatapos ng antigen stimulation. Sa aming pag-aaral, kumpara sa negatibong grupo, ang pangkat ng NPE ay may mas mataas na pagpapahayag ng IL-4, IL-17, at IFN-γ, at ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 ay mas mataas din.
Sa klinika, ang expression ng IL-17 mRNA ay nadagdagan sa mga cell ng NP mula sa mga pasyente na may disc herniation28. Ang pagtaas ng mga antas ng expression ng IL-4 at IFN-γ ay natagpuan din sa isang talamak na non-compressive disc herniation model kumpara sa malusog na mga kontrol29. Ang IL-17 ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pamamaga, pinsala sa tissue sa mga sakit na autoimmune30 at pinahuhusay ang immune response sa IFN-γ31. Ang pinahusay na IL-17-mediated tissue injury ay naiulat sa MRL/lpr mice32 at autoimmunity-susceptible mice33. Maaaring pigilan ng IL-4 ang pagpapahayag ng mga proinflammatory cytokine (tulad ng IL-1β at TNFα) at macrophage activation34. Naiulat na ang pagpapahayag ng mRNA ng IL-4 ay naiiba sa pangkat ng NPE kumpara sa IL-17 at IFN-γ sa parehong punto ng oras; Ang expression ng mRNA ng IFN-γ sa pangkat ng NPE ay makabuluhang mas mataas kaysa sa iba pang mga grupo. Samakatuwid, ang produksiyon ng IFN-γ ay maaaring isang tagapamagitan ng nagpapasiklab na tugon na sapilitan ng intercalation ng NP. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang IFN-γ ay ginawa ng maraming uri ng cell, kabilang ang activated type 1 helper T cells, natural killer cells, at macrophage35,36, at isang pangunahing pro-inflammatory cytokine na nagtataguyod ng mga immune response37.
Ang pag-aaral na ito ay nagmumungkahi na ang tugon ng autoimmune ay maaaring kasangkot sa paglitaw at pag-unlad ng MC. Luoma et al. natagpuan na ang mga katangian ng signal ng MC at kilalang NP ay magkapareho sa MRI, at parehong nagpapakita ng mataas na signal sa T2W sequence38. Ang ilang mga cytokine ay nakumpirma na malapit na nauugnay sa paglitaw ng MC, tulad ng IL-139. Ma et al. iminungkahi na ang pataas o pababang protrusion ng NP ay maaaring magkaroon ng malaking impluwensya sa paglitaw at pag-unlad ng MC12. Iniulat ni Bobechko40 at Herzbein et al.41 na ang NP ay isang immunotolerant na tissue na hindi makapasok sa vascular circulation mula sa kapanganakan. Ang mga protrusions ng NP ay nagpapakilala ng mga dayuhang katawan sa suplay ng dugo, sa gayon ay namamagitan sa mga lokal na reaksyon ng autoimmune42. Ang mga autoimmune na reaksyon ay maaaring magdulot ng malaking bilang ng mga immune factor, at kapag ang mga salik na ito ay patuloy na nakalantad sa mga tisyu, maaari silang magdulot ng mga pagbabago sa pagbibigay ng senyas43. Sa pag-aaral na ito, ang sobrang pagpapahayag ng IL-4, IL-17 at IFN-γ ay karaniwang mga kadahilanan ng immune, na higit na nagpapatunay sa malapit na ugnayan sa pagitan ng NP at MCs44. Ang modelo ng hayop na ito ay mahusay na ginagaya ang NP breakthrough at pagpasok sa dulo ng plato. Ang prosesong ito ay higit pang nagsiwalat ng epekto ng autoimmunity sa MC.
Gaya ng inaasahan, ang modelo ng hayop na ito ay nagbibigay sa amin ng isang posibleng plataporma para pag-aralan ang MC. Gayunpaman, ang modelong ito ay mayroon pa ring ilang mga limitasyon: una, sa yugto ng pagmamasid ng hayop, ang ilang mga intermediate-stage na rabbits ay kailangang i-euthanize para sa pagsusuri sa histological at molekular na biology, kaya ang ilang mga hayop ay "nawawalan ng paggamit" sa paglipas ng panahon. Pangalawa, bagama't tatlong time point ang itinakda sa pag-aaral na ito, sa kasamaang-palad, isang uri lang ng MC (Modic type I change) ang na-modelo namin, kaya hindi sapat na kumatawan sa proseso ng pag-unlad ng sakit ng tao, at mas maraming time point ang kailangang itakda sa mas mahusay na obserbahan ang lahat ng mga pagbabago sa signal. Pangatlo, ang mga pagbabago sa istraktura ng tissue ay maaaring malinaw na maipakita ng histological staining, ngunit ang ilang mga dalubhasang pamamaraan ay maaaring mas mahusay na ibunyag ang mga pagbabago sa microstructural sa modelong ito. Halimbawa, ginamit ang polarized light microscopy upang pag-aralan ang pagbuo ng fibrocartilage sa mga intervertebral disc ng kuneho45. Ang pangmatagalang epekto ng NP sa MC at endplate ay nangangailangan ng karagdagang pag-aaral.
Limampu't apat na lalaking New Zealand white rabbit (timbang na mga 2.5-3 kg, edad 3-3.5 na buwan) ay sapalarang hinati sa sham operation group, muscle implantation group (ME group) at nerve root implantation group (NPE group). Ang lahat ng mga eksperimentong pamamaraan ay inaprubahan ng Ethics Committee ng Tianjin Hospital, at ang mga eksperimentong pamamaraan ay isinagawa nang mahigpit alinsunod sa mga naaprubahang alituntunin.
Ang ilang mga pagpapabuti ay ginawa sa pamamaraan ng operasyon ng S. Sobajima 46 . Ang bawat kuneho ay inilagay sa isang lateral recumbency position at ang anterior surface ng limang magkakasunod na lumbar intervertebral disc (IVDs) ay nalantad gamit ang posterolateral retroperitoneal approach. Ang bawat kuneho ay binigyan ng pangkalahatang kawalan ng pakiramdam (20% urethane, 5 ml/kg sa pamamagitan ng ugat ng tainga). Ang isang pahaba na paghiwa ng balat ay ginawa mula sa ibabang gilid ng mga tadyang hanggang sa pelvic brim, 2 cm ventral sa mga paravertebral na kalamnan. Ang kanang anterolateral spine mula L1 hanggang L6 ay nalantad sa pamamagitan ng matalim at mapurol na dissection ng nakapatong na subcutaneous tissue, retroperitoneal tissue, at muscles (Fig. 6A). Natukoy ang antas ng disc gamit ang pelvic brim bilang isang anatomical landmark para sa L5-L6 disc level. Gumamit ng 16-gauge puncture needle para mag-drill ng butas malapit sa end plate ng L5 vertebra sa lalim na 3 mm (Fig. 6B). Gumamit ng 5-ml syringe para i-aspirate ang autologous nucleus pulposus sa L1-L2 intervertebral disc (Fig. 6C). Alisin ang nucleus pulposus o kalamnan ayon sa pangangailangan ng bawat grupo. Matapos palalimin ang drill hole, inilalagay ang absorbable sutures sa deep fascia, superficial fascia at balat, na nag-iingat na hindi makapinsala sa periosteal tissue ng vertebral body sa panahon ng operasyon.
(A) Ang L5-L6 disc ay nakalantad sa pamamagitan ng isang posterolateral retroperitoneal na diskarte. (B) Gumamit ng 16-gauge na karayom upang mag-drill ng butas malapit sa L5 endplate. (C) Ang mga Autologous MF ay inaani.
Ang pangkalahatang kawalan ng pakiramdam ay pinangangasiwaan ng 20% urethane (5 ml/kg) na ibinibigay sa pamamagitan ng ugat ng tainga, at ang mga radiograph ng lumbar spine ay inulit sa 12, 16, at 20 na linggo pagkatapos ng operasyon.
Ang mga kuneho ay isinakripisyo sa pamamagitan ng intramuscular injection ng ketamine (25.0 mg/kg) at intravenous sodium pentobarbital (1.2 g/kg) sa 12, 16 at 20 na linggo pagkatapos ng operasyon. Ang buong gulugod ay inalis para sa histological analysis at ang tunay na pagsusuri ay isinagawa. Ginamit ang quantitative reverse transcription (RT-qPCR) at Western blotting upang makita ang mga pagbabago sa mga immune factor.
Ang mga pagsusuri sa MRI ay isinagawa sa mga kuneho gamit ang isang 3.0 T clinical magnet (GE Medical Systems, Florence, SC) na nilagyan ng orthogonal limb coil receiver. Ang mga kuneho ay na-anesthetize ng 20% urethane (5 mL/kg) sa pamamagitan ng ugat ng tainga at pagkatapos ay inilagay sa loob ng magnet na may lumbar region na nakasentro sa isang 5-inch diameter na circular surface coil (GE Medical Systems). Ang Coronal T2-weighted localizer na mga imahe (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) ay nakuha upang tukuyin ang lokasyon ng lumbar disc mula L3–L4 hanggang L5–L6. Ang Sagittal plane T2-weighted slices ay nakuha gamit ang mga sumusunod na setting: fast spin-echo sequence na may repetition time (TR) na 2200 ms at isang echo time (TE) na 70 ms, matrix; visual field ng 260 at walong stimuli; Ang kapal ng pagputol ay 2 mm, ang puwang ay 0.2 mm.
Matapos makuha ang huling litrato at mapatay ang huling kuneho, ang sham, muscle-embedded, at NP disc ay tinanggal para sa histological examination. Ang mga tissue ay naayos sa 10% neutral na buffered formalin sa loob ng 1 linggo, na-decalcified na may ethylenediaminetetraacetic acid, at paraffin sectioned. Ang mga bloke ng tissue ay naka-embed sa paraffin at pinutol sa mga seksyon ng sagittal (5 μm ang kapal) gamit ang isang microtome. Ang mga seksyon ay nabahiran ng hematoxylin at eosin (H&E).
Matapos kolektahin ang mga intervertebral disc mula sa mga rabbits sa bawat grupo, ang kabuuang RNA ay nakuha gamit ang isang UNIQ-10 column (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa at isang ImProm II reverse transcription system (Promega Inc. , Madison, WI, USA). Ginawa ang reverse transcription.
Ang RT-qPCR ay isinagawa gamit ang isang Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) at SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa. Ang dami ng reaksyon ng PCR ay 20 μl at naglalaman ng 1.5 μl ng diluted cDNA at 0.2 μM ng bawat primer. Ang mga panimulang aklat ay idinisenyo ng OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) at ginawa ng Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Talahanayan 1). Ang mga sumusunod na kondisyon ng thermal cycling ay ginamit: paunang hakbang sa pag-activate ng polymerase sa 94°C sa loob ng 2 min, pagkatapos ay 40 cycle ng 15 s bawat isa sa 94°C para sa denaturation ng template, pagsusubo ng 1 min sa 60°C, extension, at fluorescence. Ang mga sukat ay isinagawa para sa 1 min sa 72 ° C. Ang lahat ng mga sample ay pinalaki ng tatlong beses at ang average na halaga ay ginamit para sa pagsusuri ng RT-qPCR. Nasuri ang data ng amplification gamit ang FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ang expression ng gene ng IL-4, IL-17, at IFN-γ ay na-normalize sa endogenous control (ACTB). Ang mga kamag-anak na antas ng pagpapahayag ng target na mRNA ay kinakalkula gamit ang 2-ΔΔCT na pamamaraan.
Ang kabuuang protina ay nakuha mula sa mga tisyu gamit ang isang tissue homogenizer sa RIPA lysis buffer (naglalaman ng isang protease at phosphatase inhibitor cocktail) at pagkatapos ay na-centrifuge sa 13,000 rpm para sa 20 min sa 4 ° C upang alisin ang mga labi ng tissue. Limampung micrograms ng protina ang na-load sa bawat lane, na pinaghiwalay ng 10% SDS-PAGE, at pagkatapos ay inilipat sa isang PVDF membrane. Ang pagharang ay isinagawa sa 5% nonfat dry milk sa Tris-buffered saline (TBS) na naglalaman ng 0.1% Tween 20 para sa 1 h sa temperatura ng silid. Ang lamad ay incubated na may rabbit anti-decorin primary antibody (diluted 1:200; Boster, Wuhan, China) (diluted 1:200; Bioss, Beijing, China) magdamag sa 4°C at nag-react sa mga ikalawang araw; na may pangalawang antibody (goat anti-rabbit immunoglobulin G sa 1:40,000 dilution) na sinamahan ng malunggay peroxidase (Boster, Wuhan, China) sa loob ng 1 oras sa temperatura ng kuwarto. Ang mga signal ng Western blot ay nakita ng tumaas na chemiluminescence sa chemiluminescent membrane pagkatapos ng X-ray irradiation. Para sa densitometric analysis, ang mga blots ay na-scan at binibilang gamit ang BandScan software at ang mga resulta ay ipinahayag bilang ratio ng target na gene immunoreactivity sa tubulin immunoreactivity.
Ang mga kalkulasyon ng istatistika ay isinagawa gamit ang SPSS16.0 software package (SPSS, USA). Ang mga datos na nakolekta sa panahon ng pag-aaral ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation (mean ± SD) at sinuri gamit ang one-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) upang matukoy ang mga pagkakaiba sa pagitan ng dalawang grupo. Ang P <0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika.
Kaya, ang pagtatatag ng isang modelo ng hayop ng MC sa pamamagitan ng pagtatanim ng mga autologous NP sa vertebral body at pagsasagawa ng macroanatomical observation, MRI analysis, histological evaluation at molecular biological analysis ay maaaring maging isang mahalagang tool para sa pagtatasa at pag-unawa sa mga mekanismo ng human MC at pagbuo ng bagong therapeutic. mga interbensyon.
Paano mabanggit ang artikulong ito: Han, C. et al. Ang isang modelo ng hayop ng mga pagbabago sa Modic ay itinatag sa pamamagitan ng pagtatanim ng autologous nucleus pulposus sa subchondral bone ng lumbar spine. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., at Boos, N. Magnetic resonance imaging ng lumbar spine: prevalence ng disc herniation at retention, nerve root compression, end plate abnormalities, at facet joint osteoarthritis sa asymptomatic volunteers . rate. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, at Leboeuf-Eed, K. Mga pagbabago sa Modic at ang kanilang kaugnayan sa mga klinikal na natuklasan. European Spine Journal: opisyal na publikasyon ng European Spine Society, ang European Society of Spinal Deformity, at ang European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modic na mga pagbabago sa lumbar vertebral endplates: pagkalat at kaugnayan sa mababang sakit sa likod at sciatica sa nasa katanghaliang-gulang na mga lalaking manggagawa. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., at Dalinka, M. MRI ng mga pagbabago sa bone marrow malapit sa end plate sa degenerative disease ng lumbar spine. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, at Carter, JR Degenerative disc disease: pagsusuri ng mga pagbabago sa vertebral marrow sa MRI. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, at Carter, JR Imaging ng degenerative disc disease. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Predictors ng neovertebral endplate (Modic) signal pagbabago sa pangkalahatang populasyon. European Spine Journal: Opisyal na Publikasyon ng European Spine Society, ang European Society of Spinal Deformity, at ang European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB at Mannisch, K. Modic ay nagbabago pagkatapos ng lumbar disc herniation. European Spine Journal : Opisyal na Publikasyon ng European Spine Society, ang European Society of Spinal Deformity at ang European Society para sa Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., at Kaapa, E. Ang mga pagbabago sa modic type I ay maaaring mahulaan ang mabilis na progresibong deformational disc degeneration: isang 1-taong prospective na pag-aaral. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ at Fan, SW Mga pagbabago sa modic: posibleng mga sanhi at kontribusyon sa lumbar disc degeneration. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Internal disc rupture. Mga problema sa disc prolapse sa loob ng 50 taon. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Oras ng post: Dis-13-2024