Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na resulta, inirerekomenda namin ang paggamit ng mas bagong browser (o pag-disable ng compatibility mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Ang pagtatatag ng mga modelo ng hayop ng modic change (MC) ay isang mahalagang batayan para sa pag-aaral ng MC. Limampu't apat na New Zealand White rabbit ang hinati sa sham-operation group, muscle implantation group (ME group) at nucleus pulposus implantation group (NPE group). Sa NPE group, ang intervertebral disc ay inilantad sa pamamagitan ng anterolateral lumbar surgical approach at isang karayom ang ginamit upang butasin ang L5 vertebral body malapit sa end plate. Ang NP ay kinuha mula sa L1/2 intervertebral disc gamit ang isang hiringgilya at tinurok dito. Pagbutas ng butas sa subchondral bone. Ang mga pamamaraan sa pag-opera at mga pamamaraan ng pagbutas sa muscle implantation group at sham-operation group ay pareho sa mga nasa NP implantation group. Sa ME group, isang piraso ng kalamnan ang inilagay sa butas, habang sa sham-operation group, walang inilagay sa butas. Pagkatapos ng operasyon, isinagawa ang MRI scanning at molecular biological testing. Nagbago ang signal sa NPE group, ngunit walang halatang pagbabago sa signal sa sham-operation group at ME group. Ipinakita ng histological na obserbasyon na naobserbahan ang abnormal na pagdami ng tisyu sa lugar ng implantasyon, at ang ekspresyon ng IL-4, IL-17 at IFN-γ ay tumaas sa grupong NPE. Ang implantasyon ng NP sa buto ng subchondral ay maaaring bumuo ng isang modelo ng hayop ng MC.
Ang mga modic changes (MC) ay mga sugat sa vertebral endplates at katabing bone marrow na nakikita sa magnetic resonance imaging (MRI). Karaniwan ang mga ito sa mga indibidwal na may kaugnay na sintomas1. Maraming pag-aaral ang nagbigay-diin sa kahalagahan ng MC dahil sa kaugnayan nito sa pananakit ng mababang bahagi ng likod (LBP)2,3. Malayang unang inilarawan nina de Roos et al.4 at Modic et al.5 ang tatlong magkakaibang uri ng abnormalidad sa subchondral signal sa vertebral bone marrow. Ang mga modic type I na pagbabago ay hypointense sa mga T1-weighted (T1W) sequences at hyperintense sa mga T2-weighted (T2W) sequences. Ang sugat na ito ay nagpapakita ng mga fissure endplates at katabing vascular granulation tissue sa bone marrow. Ang mga modic type II na pagbabago ay nagpapakita ng mataas na signal sa parehong T1W at T2W sequences. Sa ganitong uri ng sugat, matatagpuan ang pagkasira ng endplate, pati na rin ang histological fatty replacement ng katabing bone marrow. Ang mga modic type III na pagbabago ay nagpapakita ng mababang signal sa mga T1W at T2W sequences. Naobserbahan ang mga sclerotic lesion na katumbas ng mga endplate6. Ang MC ay itinuturing na isang pathological na sakit ng gulugod at malapit na nauugnay sa maraming degenerative na sakit ng gulugod7,8,9.
Kung isasaalang-alang ang mga magagamit na datos, ilang pag-aaral ang nagbigay ng detalyadong pananaw sa etiology at pathological mechanisms ng MC. Iminungkahi nina Albert et al. na ang MC ay maaaring sanhi ng disc herniation8. Iniugnay nina Hu et al. ang MC sa matinding disc degeneration10. Iminungkahi ni Kroc ang konsepto ng "internal disc rupture," na nagsasaad na ang paulit-ulit na disc trauma ay maaaring humantong sa mga microtear sa endplate. Pagkatapos ng pagbuo ng cleft, ang pagkasira ng endplate ng nucleus pulposus (NP) ay maaaring magdulot ng autoimmune response, na higit pang humahantong sa pag-unlad ng MC11. Nagbahagi si Ma et al. ng katulad na pananaw at iniulat na ang NP-induced autoimmunity ay gumaganap ng mahalagang papel sa pathogenesis ng MC12.
Ang mga selula ng immune system, lalo na ang mga CD4+ T helper lymphocytes, ay may mahalagang papel sa pathogenesis ng autoimmunity13. Ang kamakailang natuklasang Th17 subset ay gumagawa ng proinflammatory cytokine na IL-17, nagtataguyod ng chemokine expression, at nagpapasigla sa mga T cell sa mga nasirang organo upang makagawa ng IFN-γ14. Ang mga Th2 cell ay gumaganap din ng kakaibang papel sa pathogenesis ng mga tugon ng immune system. Ang ekspresyon ng IL-4 bilang isang kinatawan na Th2 cell ay maaaring humantong sa malubhang immunopathological na mga kahihinatnan15.
Bagama't maraming klinikal na pag-aaral ang isinagawa sa MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, mayroon pa ring kakulangan ng angkop na mga modelong pang-eksperimento sa hayop na maaaring gayahin ang proseso ng MC na madalas na nangyayari sa mga tao at maaaring gamitin upang siyasatin ang etiology o mga bagong paggamot tulad ng naka-target na therapy. Sa ngayon, kakaunti lamang na mga modelo ng hayop ng MC ang naiulat na nag-aaral sa pinagbabatayan na mga mekanismo ng patolohiya.
Batay sa teoryang autoimmune na iminungkahi nina Albert at Ma, ang pag-aaral na ito ay nagtatag ng isang simple at maaaring kopyahing modelo ng MC ng kuneho sa pamamagitan ng autotransplanting ng NP malapit sa drilled vertebral end plate. Ang iba pang mga layunin ay upang obserbahan ang mga histological na katangian ng mga modelo ng hayop at suriin ang mga partikular na mekanismo ng NP sa pag-unlad ng MC. Para dito, gumagamit kami ng mga pamamaraan tulad ng molecular biology, MRI, at mga histological na pag-aaral upang pag-aralan ang pag-unlad ng MC.
Dalawang kuneho ang namatay dahil sa pagdurugo habang isinasagawa ang operasyon, at apat na kuneho ang namatay habang isinailalim sa anesthesia habang sumasailalim sa MRI. Ang natitirang 48 kuneho ay nakaligtas at hindi nagpakita ng anumang senyales sa pag-uugali o neurolohikal pagkatapos ng operasyon.
Ipinapakita ng MRI na ang intensidad ng signal ng nakabaong tisyu sa iba't ibang butas ay magkakaiba. Ang intensidad ng signal ng L5 vertebral body sa grupo ng NPE ay unti-unting nagbago sa 12, 16 at 20 linggo pagkatapos ng pagpasok (ang pagkakasunod-sunod ng T1W ay nagpakita ng mababang signal, at ang pagkakasunod-sunod ng T2W ay nagpakita ng magkahalong signal at mababang signal) (Fig. 1C), habang ang anyo ng MRI ng iba pang dalawang grupo ng mga nakabaong bahagi ay nanatiling medyo matatag sa parehong panahon (Fig. 1A, B).
(A) Mga representatibong magkakasunod na MRI ng kuneho na lumbar spine sa 3 punto ng oras. Walang natagpuang abnormalidad sa signal sa mga imahe ng sham-operation group. (B) Ang mga katangian ng signal ng vertebral body sa ME group ay katulad ng sa sham-operation group, at walang naobserbahang makabuluhang pagbabago sa signal sa embedding site sa paglipas ng panahon. (C) Sa NPE group, ang low signal ay malinaw na nakikita sa T1W sequence, at ang mixed signal at low signal ay malinaw na nakikita sa T2W sequence. Mula sa 12-linggong panahon hanggang sa 20-linggong panahon, ang mga sporadic high signal na nakapalibot sa low signal sa T2W sequence ay bumababa.
Makikita ang halatang bone hyperplasia sa implantation site ng vertebral body sa NPE group, at ang bone hyperplasia ay nangyayari nang mas mabilis mula 12 hanggang 20 linggo (Fig. 2C) kumpara sa NPE group, walang naobserbahang makabuluhang pagbabago sa mga minodelo na vertebral bodies; Sham group at ME group (Fig. 2C) 2A,B).
(A) Ang ibabaw ng vertebral body sa itinanim na bahagi ay napakakinis, ang butas ay gumagaling nang maayos, at walang hyperplasia sa vertebral body. (B) Ang hugis ng itinanim na bahagi sa ME group ay katulad ng sa sham operation group, at walang malinaw na pagbabago sa hitsura ng itinanim na bahagi sa paglipas ng panahon. (C) Ang bone hyperplasia ay naganap sa itinanim na bahagi sa NPE group. Ang bone hyperplasia ay mabilis na tumaas at lumawak pa sa intervertebral disc hanggang sa contralateral vertebral body.
Ang histological analysis ay nagbibigay ng mas detalyadong impormasyon tungkol sa pagbuo ng buto. Ipinapakita ng Figure 3 ang mga litrato ng mga postoperative section na kinulayan ng H&E. Sa sham-operation group, maayos ang pagkakaayos ng mga chondrocyte at walang nakitang pagdami ng selula (Fig. 3A). Ang sitwasyon sa ME group ay katulad ng sa sham-operation group (Fig. 3B). Gayunpaman, sa NPE group, malaking bilang ng mga chondrocyte at pagdami ng mga NP-like cell ang naobserbahan sa implantation site (Fig. 3C);
(A) Makikita ang mga trabeculae malapit sa end plate, ang mga chondrocyte ay maayos na nakaayos na may pare-parehong laki at hugis ng selula at walang pagdami (40 beses). (B) Ang kondisyon ng implantation site sa ME group ay katulad ng sa sham group. Makikita ang mga trabeculae at chondrocyte, ngunit walang halatang pagdami sa implantation site (40 beses). (B) Makikita na ang mga chondrocyte at NP-like cells ay dumarami nang malaki, at ang hugis at laki ng mga chondrocyte ay hindi pantay (40 beses).
Ang ekspresyon ng interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA, at interferon γ (IFN-γ) mRNA ay naobserbahan sa parehong grupo ng NPE at ME. Nang ikumpara ang mga antas ng ekspresyon ng mga target gene, ang mga ekspresyon ng gene ng IL-4, IL-17, at IFN-γ ay tumaas nang malaki sa grupo ng NPE kumpara sa grupo ng ME at sa grupo ng sham operation (Fig. 4) (P < 0.05). Kung ikukumpara sa grupo ng sham operation, ang mga antas ng ekspresyon ng IL-4, IL-17, at IFN-γ sa grupo ng ME ay tumaas lamang nang bahagya at hindi umabot sa istatistikal na pagbabago (P > 0.05).
Ang mRNA expression ng IL-4, IL-17 at IFN-γ sa NPE group ay nagpakita ng mas mataas na trend kumpara sa mga nasa sham operation group at ME group (P < 0.05).
Sa kabaligtaran, ang mga antas ng ekspresyon sa grupong ME ay hindi nagpakita ng makabuluhang pagkakaiba (P>0.05).
Isinagawa ang pagsusuring Western blot gamit ang mga komersyal na makukuhang antibodies laban sa IL-4 at IL-17 upang kumpirmahin ang nabagong pattern ng ekspresyon ng mRNA. Gaya ng ipinapakita sa Mga Larawan 5A, B, kumpara sa grupong ME at sa grupong sham operation, ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 sa grupong NPE ay tumaas nang malaki (P < 0.05). Kung ikukumpara sa grupong sham operation, ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 sa grupong ME ay nabigo ring umabot sa mga makabuluhang pagbabago sa istatistika (P> 0.05).
(A) Ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 sa grupong NPE ay mas mataas nang malaki kaysa sa mga nasa grupong ME at grupong placebo (P < 0.05). (B) Western blot histogram.
Dahil sa limitadong bilang ng mga sample ng tao na nakuha sa panahon ng operasyon, medyo mahirap ang malinaw at detalyadong mga pag-aaral sa pathogenesis ng MC. Sinubukan naming magtatag ng isang modelo ng hayop ng MC upang pag-aralan ang mga potensyal na mekanismo ng patolohiya nito. Kasabay nito, ginamit ang radiological evaluation, histological evaluation, at molecular biological evaluation upang sundan ang takbo ng MC na dulot ng NP autograft. Bilang resulta, ang NP implantation model ay nagresulta sa unti-unting pagbabago sa intensity ng signal mula 12-linggo hanggang 20-linggong mga time point (magkahalong low signal sa mga T1W sequence at low signal sa mga T2W sequence), na nagpapahiwatig ng mga pagbabago sa tissue, at kinumpirma ng histological at molecular biological evaluations ang mga resulta ng radiological study.
Ang mga resulta ng eksperimentong ito ay nagpapakita na ang mga pagbabago sa paningin at histolohiya ay naganap sa lugar ng paglabag sa vertebral body sa grupong NPE. Kasabay nito, naobserbahan ang ekspresyon ng mga gene na IL-4, IL-17 at IFN-γ, pati na rin ang IL-4, IL-17 at IFN-γ, na nagpapahiwatig na ang paglabag sa autologous nucleus pulposus tissue sa vertebral body ay maaaring magdulot ng serye ng mga pagbabago sa signal at morpolohiya. Madaling makita na ang mga katangian ng signal ng mga vertebral body ng modelo ng hayop (mababang signal sa T1W sequence, mixed signal at mababang signal sa T2W sequence) ay halos kapareho ng sa mga vertebral cell ng tao, at kinukumpirma rin ng mga katangian ng MRI ang mga obserbasyon ng histology at gross anatomy, ibig sabihin, ang mga pagbabago sa mga vertebral body cell ay progresibo. Bagama't ang tugon ng pamamaga na dulot ng talamak na trauma ay maaaring lumitaw pagkatapos ng pagbutas, ipinakita ng mga resulta ng MRI na ang unti-unting pagtaas ng mga pagbabago sa signal ay lumitaw 12 linggo pagkatapos ng pagbutas at nagpatuloy hanggang 20 linggo nang walang anumang senyales ng paggaling o pagbaligtad ng mga pagbabago sa MRI. Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang autologous vertebral NP ay isang maaasahang pamamaraan para sa pagtatatag ng progresibong MV sa mga kuneho.
Ang modelong ito ng pagbutas ay nangangailangan ng sapat na kasanayan, oras, at pagsisikap sa operasyon. Sa mga paunang eksperimento, ang pagtanggal o labis na pagpapasigla ng mga istrukturang paravertebral ligamentous ay maaaring magresulta sa pagbuo ng mga vertebral osteophyte. Dapat mag-ingat na huwag masira o mairita ang mga katabing disc. Dahil ang lalim ng pagtagos ay dapat kontrolin upang makakuha ng pare-pareho at maaaring kopyahin na mga resulta, manu-mano kaming gumawa ng isang plug sa pamamagitan ng pagputol sa kaluban ng isang 3 mm na haba ng karayom. Tinitiyak ng paggamit ng plug na ito ang pantay na lalim ng pagbabarena sa vertebral body. Sa mga paunang eksperimento, natuklasan ng tatlong orthopedic surgeon na kasangkot sa operasyon na mas madaling gamitin ang 16-gauge na karayom kaysa sa 18-gauge na karayom o iba pang mga pamamaraan. Upang maiwasan ang labis na pagdurugo habang nagbubutas, ang paghawak nang hindi gumagalaw sa karayom nang ilang sandali ay magbibigay ng mas angkop na butas sa pagpasok, na nagmumungkahi na ang isang tiyak na antas ng MC ay maaaring kontrolin sa ganitong paraan.
Bagama't maraming pag-aaral ang tumutok sa MC, kakaunti ang nalalaman tungkol sa etiology at pathogenesis ng MC25,26,27. Batay sa aming mga nakaraang pag-aaral, natuklasan namin na ang autoimmunity ay may mahalagang papel sa paglitaw at pag-unlad ng MC12. Sinuri ng pag-aaral na ito ang quantitative expression ng IL-4, IL-17, at IFN-γ, na siyang pangunahing differentiation pathways ng mga CD4+ cell pagkatapos ng antigen stimulation. Sa aming pag-aaral, kumpara sa negatibong grupo, ang grupo ng NPE ay may mas mataas na expression ng IL-4, IL-17, at IFN-γ, at ang mga antas ng protina ng IL-4 at IL-17 ay mas mataas din.
Sa klinikal na paraan, ang ekspresyon ng IL-17 mRNA ay tumataas sa mga NP cell mula sa mga pasyenteng may disc herniation28. Ang pagtaas ng antas ng ekspresyon ng IL-4 at IFN-γ ay natagpuan din sa isang acute non-compressive disc herniation model kumpara sa malulusog na kontrol29. Ang IL-17 ay gumaganap ng mahalagang papel sa pamamaga, pinsala sa tisyu sa mga autoimmune disease30 at nagpapahusay sa immune response sa IFN-γ31. Ang pinahusay na pinsala sa tisyu na namamagitan sa IL-17 ay naiulat sa mga MRL/lpr mice32 at mga autoimmunity-susceptible mice33. Maaaring pigilan ng IL-4 ang ekspresyon ng mga proinflammatory cytokine (tulad ng IL-1β at TNFα) at macrophage activation34. Naiulat na ang ekspresyon ng mRNA ng IL-4 ay naiiba sa grupo ng NPE kumpara sa IL-17 at IFN-γ nang sabay; Ang ekspresyon ng mRNA ng IFN-γ sa grupo ng NPE ay mas mataas nang malaki kaysa sa iba pang mga grupo. Samakatuwid, ang produksyon ng IFN-γ ay maaaring isang tagapamagitan ng tugon ng pamamaga na dulot ng NP intercalation. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang IFN-γ ay nalilikha ng maraming uri ng selula, kabilang ang mga na-activate na type 1 helper T cells, natural killer cells, at macrophages35,36, at isang mahalagang pro-inflammatory cytokine na nagtataguyod ng mga tugon ng immune system37.
Ipinahihiwatig ng pag-aaral na ito na ang autoimmune response ay maaaring may kinalaman sa paglitaw at pag-unlad ng MC. Natuklasan nina Luoma et al. na ang mga katangian ng signal ng MC at prominenteng NP ay magkatulad sa MRI, at parehong nagpapakita ng mataas na signal sa T2W sequence38. Ang ilang cytokine ay nakumpirmang malapit na nauugnay sa paglitaw ng MC, tulad ng IL-139. Iminungkahi nina Ma et al. na ang pataas o pababa na pag-usli ng NP ay maaaring magkaroon ng malaking impluwensya sa paglitaw at pag-unlad ng MC12. Iniulat nina Bobechko40 at Herzbein et al.41 na ang NP ay isang immunotolerant tissue na hindi maaaring makapasok sa vascular circulation mula sa pagkapanganak. Ang mga pag-usli ng NP ay nagpapakilala ng mga banyagang katawan sa suplay ng dugo, sa gayon ay namamagitan sa mga lokal na autoimmune reaction42. Ang mga autoimmune reaction ay maaaring mag-udyok ng maraming immune factor, at kapag ang mga salik na ito ay patuloy na nalalantad sa mga tisyu, maaari silang magdulot ng mga pagbabago sa signaling43. Sa pag-aaral na ito, ang overexpression ng IL-4, IL-17 at IFN-γ ay mga tipikal na immune factor, na lalong nagpapatunay sa malapit na ugnayan sa pagitan ng NP at MCs44. Ginagaya nang maayos ng modelong hayop na ito ang tagumpay at pagpasok ng NP sa end plate. Lalo pang ipinakita ng prosesong ito ang epekto ng autoimmunity sa MC.
Gaya ng inaasahan, ang modelong ito ng hayop ay nagbibigay sa atin ng isang posibleng plataporma upang pag-aralan ang MC. Gayunpaman, ang modelong ito ay mayroon pa ring ilang mga limitasyon: una, sa panahon ng yugto ng pagmamasid sa hayop, ang ilang mga kuneho na nasa gitnang yugto ay kailangang i-euthanize para sa pagsusuri sa histological at molecular biology, kaya ang ilang mga hayop ay "hindi na ginagamit" sa paglipas ng panahon. Pangalawa, bagama't tatlong punto ng oras ang itinakda sa pag-aaral na ito, sa kasamaang palad, isang uri lamang ng MC (Modic type I change) ang aming minodelo, kaya hindi ito sapat upang kumatawan sa proseso ng pag-unlad ng sakit ng tao, at mas maraming punto ng oras ang kailangang itakda upang mas mahusay na maobserbahan ang lahat ng mga pagbabago sa signal. Pangatlo, ang mga pagbabago sa istraktura ng tisyu ay maaaring malinaw na maipakita sa pamamagitan ng histological staining, ngunit ang ilang mga espesyalisadong pamamaraan ay maaaring mas mahusay na maipakita ang mga pagbabago sa microstructural sa modelong ito. Halimbawa, ginamit ang polarized light microscopy upang suriin ang pagbuo ng fibrocartilage sa mga intervertebral disc ng kuneho45. Ang pangmatagalang epekto ng NP sa MC at endplate ay nangangailangan ng karagdagang pag-aaral.
Limampu't apat na lalaking puting kuneho ng New Zealand (timbang na humigit-kumulang 2.5-3 kg, edad na 3-3.5 buwan) ay sapalarang hinati sa grupo ng sham operation, grupo ng muscle implantation (ME group) at grupo ng nerve root implantation (NPE group). Inaprubahan ng Ethics Committee ng Tianjin Hospital ang lahat ng mga pamamaraang pang-eksperimento, at ang mga pamamaraang pang-eksperimento ay isinagawa nang mahigpit alinsunod sa mga aprubadong alituntunin.
May ilang mga pagpapabuti na nagawa sa pamamaraan ng pag-opera ni S. Sobajima 46. Ang bawat kuneho ay inilagay sa posisyong lateral recumbency at ang anterior surface ng limang magkakasunod na lumbar intervertebral discs (IVDs) ay inilantad gamit ang posterolateral retroperitoneal approach. Ang bawat kuneho ay binigyan ng general anesthesia (20% urethane, 5 ml/kg sa pamamagitan ng ugat sa tainga). Isang longitudinal skin incision ang ginawa mula sa ibabang gilid ng mga tadyang hanggang sa pelvic brim, 2 cm ventral hanggang sa paravertebral muscles. Ang kanang anterolateral spine mula L1 hanggang L6 ay inilantad sa pamamagitan ng matalas at blunt dissection ng nakapatong na subcutaneous tissue, retroperitoneal tissue, at mga kalamnan (Fig. 6A). Ang antas ng disc ay natukoy gamit ang pelvic brim bilang anatomical landmark para sa antas ng disc ng L5-L6. Gumamit ng 16-gauge puncture needle upang magbutas malapit sa end plate ng L5 vertebra hanggang sa lalim na 3 mm (Fig. 6B). Gumamit ng 5-ml na hiringgilya upang sipsipin ang autologous nucleus pulposus sa L1-L2 intervertebral disc (Fig. 6C). Tanggalin ang nucleus pulposus o kalamnan ayon sa mga kinakailangan ng bawat grupo. Matapos mapalalim ang butas, ilalagay ang mga nasisipsip na tahi sa malalim na fascia, mababaw na fascia at balat, habang nag-iingat na hindi mapinsala ang periosteal tissue ng vertebral body habang isinasagawa ang operasyon.
(A) Ang L5–L6 disc ay inilalantad sa pamamagitan ng posterolateral retroperitoneal approach. (B) Gumamit ng 16-gauge na karayom upang magbutas malapit sa L5 endplate. (C) Kinukuha ang mga Autologous MF.
Ibinigay ang pangkalahatang kawalan ng pakiramdam gamit ang 20% urethane (5 ml/kg) na ipinasok sa pamamagitan ng ugat sa tainga, at ang mga radiograph sa lumbar spine ay inulit sa ika-12, ika-16, at ika-20 linggo pagkatapos ng operasyon.
Ang mga kuneho ay pinatay sa pamamagitan ng intramuscular injection ng ketamine (25.0 mg/kg) at intravenous sodium pentobarbital (1.2 g/kg) pagkalipas ng 12, 16 at 20 linggo pagkatapos ng operasyon. Ang buong gulugod ay tinanggal para sa histological analysis at isinagawa ang totoong pagsusuri. Ginamit ang quantitative reverse transcription (RT-qPCR) at Western blotting upang matukoy ang mga pagbabago sa mga immune factor.
Isinagawa ang mga eksaminasyon ng MRI sa mga kuneho gamit ang isang 3.0 T clinical magnet (GE Medical Systems, Florence, SC) na nilagyan ng orthogonal limb coil receiver. Ang mga kuneho ay binigyan ng pampamanhid gamit ang 20% urethane (5 mL/kg) sa pamamagitan ng ugat sa tainga at pagkatapos ay inilagay nang nakatihaya sa loob ng magnet na ang rehiyon ng lumbar ay nakasentro sa isang 5-pulgadang diyametrong pabilog na ibabaw na coil (GE Medical Systems). Ang mga imahe ng Coronal T2-weighted localizer (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) ay kinuha upang tukuyin ang lokasyon ng lumbar disc mula L3–L4 hanggang L5–L6. Ang mga sagittal plane T2-weighted slices ay nakuha gamit ang mga sumusunod na setting: mabilis na spin-echo sequence na may repetition time (TR) na 2200 ms at echo time (TE) na 70 ms, matrix; visual field na 260 at walong stimuli; Ang kapal ng pagputol ay 2 mm, ang puwang ay 0.2 mm.
Matapos makuha ang huling litrato at mapatay ang huling kuneho, ang sham, muscle-embedded, at NP discs ay tinanggal para sa histological examination. Ang mga tissue ay inayos sa 10% neutral buffered formalin sa loob ng 1 linggo, tinanggalan ng calcification gamit ang ethylenediaminetetraacetic acid, at hiniwa gamit ang paraffin. Ang mga tissue block ay inilagay sa paraffin at hiniwa sa sagittal sections (5 μm ang kapal) gamit ang microtome. Ang mga sections ay kinulayan gamit ang hematoxylin at eosin (H&E).
Matapos kolektahin ang mga intervertebral disc mula sa mga kuneho sa bawat grupo, ang kabuuang RNA ay kinuha gamit ang isang UNIQ-10 column (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa at isang ImProm II reverse transcription system (Promega Inc., Madison, WI, USA). Isinagawa ang reverse transcription.
Isinagawa ang RT-qPCR gamit ang isang Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) at SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Ang dami ng reaksyon ng PCR ay 20 μl at naglalaman ng 1.5 μl ng diluted cDNA at 0.2 μM ng bawat primer. Ang mga primer ay dinisenyo ng OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) at ginawa ng Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Talahanayan 1). Ang mga sumusunod na kondisyon ng thermal cycling ang ginamit: paunang hakbang ng polymerase activation sa 94°C sa loob ng 2 minuto, pagkatapos ay 40 cycle na may 15 segundo bawat isa sa 94°C para sa template denaturation, annealing sa loob ng 1 minuto sa 60°C, extension, at fluorescence. Ang mga pagsukat ay isinagawa sa loob ng 1 minuto sa 72°C. Lahat ng sample ay pinalaki nang tatlong beses at ang average na halaga ay ginamit para sa pagsusuri ng RT-qPCR. Sinuri ang datos ng amplipikasyon gamit ang FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ang ekspresyon ng gene na IL-4, IL-17, at IFN-γ ay na-normalize sa endogenous control (ACTB). Ang mga relatibong antas ng ekspresyon ng target mRNA ay kinalkula gamit ang 2-ΔΔCT na pamamaraan.
Ang kabuuang protina ay kinuha mula sa mga tisyu gamit ang isang tissue homogenizer sa RIPA lysis buffer (naglalaman ng protease at phosphatase inhibitor cocktail) at pagkatapos ay sinentrifuga sa 13,000 rpm sa loob ng 20 minuto sa 4°C upang alisin ang mga debris ng tisyu. Limampung micrograms ng protina ang nilagyan ng laman bawat lane, pinaghiwalay ng 10% SDS-PAGE, at pagkatapos ay inilipat sa isang PVDF membrane. Ang pagharang ay isinagawa sa 5% nonfat dry milk sa Tris-buffered saline (TBS) na naglalaman ng 0.1% Tween 20 sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid. Ang membrane ay in-incubate gamit ang rabbit anti-decorin primary antibody (diluted 1:200; Boster, Wuhan, China) (diluted 1:200; Bioss, Beijing, China) magdamag sa 4°C at nag-react sa mga ikalawang araw; na may pangalawang antibody (goat anti-rabbit immunoglobulin G sa 1:40,000 dilution) na sinamahan ng horseradish peroxidase (Boster, Wuhan, China) sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid. Ang mga signal ng Western blot ay natukoy sa pamamagitan ng pagtaas ng chemiluminescence sa chemiluminescent membrane pagkatapos ng X-ray irradiation. Para sa densitometric analysis, ang mga blot ay na-scan at na-quantify gamit ang BandScan software at ang mga resulta ay ipinahayag bilang ratio ng target gene immunoreactivity sa tubulin immunoreactivity.
Isinagawa ang mga kalkulasyon sa istatistika gamit ang SPSS16.0 software package (SPSS, USA). Ang mga datos na nakalap sa panahon ng pag-aaral ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation (mean ± SD) at sinuri gamit ang one-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) upang matukoy ang mga pagkakaiba sa pagitan ng dalawang grupo. Ang P < 0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika.
Kaya naman, ang pagtatatag ng isang modelo ng hayop ng MC sa pamamagitan ng pagtatanim ng mga autologous NP sa vertebral body at pagsasagawa ng macroanatomical observation, MRI analysis, histological evaluation at molecular biological analysis ay maaaring maging isang mahalagang kasangkapan para sa pagtatasa at pag-unawa sa mga mekanismo ng human MC at pagbuo ng mga bagong therapeutic intervention.
Paano banggitin ang artikulong ito: Han, C. et al. Isang modelo ng hayop ng mga pagbabagong Modic ang itinatag sa pamamagitan ng pagtatanim ng autologous nucleus pulposus sa subchondral bone ng lumbar spine. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., at Boos, N. Magnetic resonance imaging ng lumbar spine: paglaganap ng disc herniation at retention, nerve root compression, mga abnormalidad sa end plate, at facet joint osteoarthritis sa mga asymptomatic volunteer. rate. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, at Leboeuf-Eed, K. Mga pagbabagong modic at ang kanilang kaugnayan sa mga klinikal na natuklasan. European Spine Journal: opisyal na publikasyon ng European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, at European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Mga pagbabago sa lumbar vertebral endplates: paglaganap at kaugnayan sa pananakit ng mababang likod at sciatica sa mga lalaking manggagawang nasa katanghaliang-gulang. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., at Dalinka, M. MRI ng mga pagbabago sa utak ng buto malapit sa end plate sa degenerative na sakit ng lumbar spine. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, at Carter, JR Degenerative disc disease: pagsusuri ng mga pagbabago sa vertebral marrow gamit ang MRI. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, at Carter, JR Pag-imahe ng degenerative disc disease. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Ang mga tagahula ng neovertebral endplate (Modic) ay nagbibigay ng senyales ng mga pagbabago sa pangkalahatang populasyon. European Spine Journal: Opisyal na Publikasyon ng European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, at European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB at Mannisch, K. Mga pagbabagong modiko pagkatapos ng herniation ng lumbar disc. European Spine Journal: Opisyal na Publikasyon ng European Spine Society, European Society of Spinal Deformity at European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., at Kaapa, E. Ang mga pagbabago sa modic type I ay maaaring mahulaan ang mabilis na progresibong deformational disc degeneration: isang 1-taong prospektibong pag-aaral. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ at Fan, SW Mga pagbabagong modiko: mga posibleng sanhi at kontribusyon sa pagkabulok ng lumbar disc. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Panloob na pagkapunit ng disc. Mga problema sa disc prolapse sa loob ng 50 taon. Gulugod (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Oras ng pag-post: Disyembre 13, 2024